枯草杆菌脂肪酶的基因克隆、定向进化与非水酶学研究

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本文从原始的枯草杆菌质粒pBD64 出发,通过设计两段DNA片段,引入了多个酶切位点和一个强启动子序列,构建了一个枯草杆菌脂肪酶高表达质粒pBSR2;该质粒载体与一段成熟的脂肪酶基因相连接,在枯草杆菌宿主中实现了高效表达。通过对枯草杆菌脂肪酶BSL 的表达、分离和纯化,进一步研究了这种酶的分子量、酶活力、最适反应温度、最适反应pH、反应动力学等基本酶学性质。 通过采用易错PCR 和DNA 改组策略,对枯草杆菌脂肪酶进行了酶活力定向进化研究。经过两轮的易错PCR 和一轮的DNA改组,获得了一株酶活力提高4.5 倍的突变体。对突变菌株进行表达纯化后,对其酶学性质也进行了与野生型的对比研究。经基因测序和蛋白分析,进一步解释了对突变体酶活力和稳定性提高的可能机制。 在应用枯草杆菌脂肪酶催化拆分外消旋2-辛醇的研究中发现,底物的摩尔比、酶的用量、反应温度、水含量以及反应前酶冻干时所处缓冲液的pH、离子强度等因素都对反应的催化活性及立体选择性的有着较大的影响。
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