目的肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae, S.pn)是严重侵袭性感染和上呼吸道感染最重要的病原体之一,使用有效的疫苗预防其感染是一个重要手段,WHO建议将S.pn结合疫苗纳入国家免疫计划,目前S.pn疫苗为全球最急需的前3位疫苗之一。肺炎链球菌DnaJ(Hsp40)是热休克蛋白40家族的成员之一,重组蛋白DnaJ腹腔免疫BALB/C小鼠后,可抵御血清型3型肺炎链球菌致死剂量的鼻腔感染,具有保护效果[1]。然而尚不清楚,重组蛋白DnaJ作为免疫原是否对不同血清型的肺炎链球菌均具有保护作用,其经鼻腔粘膜途径免疫是否具有免疫原性、是否能够保护宿主抵御S.pn致死性感染及其发挥作用的免疫学机制。本研究拟对DnaJ的相关免疫保护作用及机制进行研究。方法原核表达并纯化DnaJ全长蛋白,重组蛋白腹腔免疫BALB/C小鼠,制备DnaJ特异性抗血清。菌落PCR及Western blot分析DnaJ在肺炎链球菌不同血清型菌株的表达及保守性。重组蛋白DnaJ经腹腔和粘膜两种途径免疫BALB/C小鼠,建立相应的S.pn感染模型,评价其主动免疫保护效果;间接ELISA分别检测免疫后血清中抗体亚型、脾细胞培养上清的细胞因子水平;19F型S.pn经鼻腔感染粘膜免疫的小鼠,取鼻腔灌洗液和肺匀浆,铺板计数其中细菌数。采用R6型肺炎链球菌吸附抗体实验、被动免疫保护实验,评价DnaJ特异性抗体的效果;通过黏附A549细胞实验检测抗血清对细菌黏附的抑制作用。结果肺炎链球菌DnaJ片段被正确克隆到pET-32(a)载体中。重组工程菌经IPTG诱导得到可溶形式表达的重组蛋白,Ni-NTA亲和层析纯化后,获得纯度>90%的纯化蛋白。菌落PCR及Western blot检测发现,DnaJ在S.pn血清型2型,3型,6B型,14型,19F型及R6菌株中均有表达,保守性好。重组蛋白经腹腔及鼻粘膜两种途径免疫BALB/C小鼠均可以抵御致死性S.pn的感染,其中,腹腔免疫对血清型2型,3型,6B型及14型的保护效率分别为50%,50%,58.3%,41.7%,而粘膜免疫对血清型2型,3型,6B型及14型的保护效率分别为58.3%,66.7%,66.7%,50%;DnaJ蛋白经腹腔免疫途径主要刺激宿主产生IgG1,抗体滴度达4.27×106;经粘膜免疫途径主要刺激宿主IgG2b,抗体滴度达2.13×106。同时,粘膜免疫途径还刺激宿主高水平的细胞因子IL-10、IFN-γ和IL-17A,剂量分别为239.11±168.77,55.86±39.25,765.68±159.11(pg/ml)。抗定植实验结果显示,特异性抗血清能够显著减少小鼠鼻咽部及肺部定植的细菌数量(P<0.05)。DnaJ特异性抗血清被动免疫BALB/C小鼠,可显著延长小鼠生存时间,提高小鼠生存率,其保护效率达50%;抗血清与R6型S.pn孵育后,血清中DnaJ特异性抗体效价显著下降,小鼠生存时间明显缩短,保护作用消失(P<0.05)。同时,抗血清可以有效抑制肺炎链球菌黏附A549上皮细胞。结论上述结果显示,DnaJ蛋白在多种血清型S.pn中均有表达,具有较好的保守性。DnaJ蛋白通过腹腔免疫途径可以刺激宿主产生体液免疫反应,能有效抵御四种致病性血清型S.pn的致死性感染,其保护作用依赖于其特异性抗体;DnaJ蛋白通过粘膜免疫途径不仅可以刺激宿主产生体液免疫反应,还有效激发了细胞免疫反应,能有效抵御四种致病性血清型肺炎链球菌的鼻腔感染,具有较好的保护作用;同时,DnaJ蛋白通过粘膜免疫还可刺激宿主产生高水平的IL-17A,能有效抵御S.pn在鼻咽部的定植。