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目的:1.建立简单、特异、灵敏、可靠的高效液相色谱串联-质谱(LC-MS/MS)法测定INS-1细胞中芒果苷的浓度。2.LC-MS/MS法测定不同剂量芒果苷单体在正常INS-1的细胞药代动力学特征;以及同一剂量芒果苷在正常和氧化损伤模型细胞的药代动力学特征;并进一步测定芒果苷单体、知母单煎液、知母-黄柏药对煎液给药后芒果苷的细胞药代动力学参数,并比较差异。3.采用差速离心法分离提取细胞浆、细胞核、线粒体。采用已建立的LC-MS/MS法测定正常和氧化损伤组INS-1细胞各细胞器分布芒果苷的含量,并比较差异。方法:1.建立INS-1细胞中芒果苷浓度的LC-MS/MS测定方法:细胞给药不同时间收集细胞,以超声朕合反复冻融法破碎细胞,经乙腈:乙酸(V/V 40:1)沉淀蛋白后收集样品;色谱柱为美国安捷伦 Agilent Eclipse Plus C18柱(150×2.1mm,3.5 μm);洗脱方式:梯度洗脱;流动相A为1%冰乙酸水溶液,流动相B为甲醇,0～2.0 min,20%B;2.0～4.0 min,20%～70%B;4.0～4.5 min,70%～20%B;4.5～7.0 min,20%B;流速:300 μL·min-1;柱温:35℃;进样量:10 μ L。在电喷雾离子化(ESI)和正离子多反应检测(MRM)模式下运用QTRAP 6500+型液质联用仪测定,用于定量分析的离子对为:m/z 423.0→273.2(芒果苷);m/z61 1.5→303.0(内标芦丁)。2.芒果苷在INS-1细胞内药代动力学研究:芒果苷单体50、100、500 μ mol·L-1剂量给药正常INS-1细胞;同一剂量(100μmol·L-1)芒果苷分别给药正常和氧化损伤INS-1细胞;芒果苷单体液、知母单煎液、黄柏-知母药对煎液给药正常INS-1细胞,按不同时间点取样,通过LC-MS/MS法测定各剂量下不同时间细胞中芒果苷浓度,绘制胞内药物浓度-时间曲线,并计算其AUC、Cmax、Tmax、T12等主要动力学参数,以参数描述芒果苷在I NS-1细胞内药物代谢动力学特征,并分析其中差异。3.芒果苷在INS-1细胞中各细胞器的分布:正常和氧化损伤的INS-1细胞给药中剂量芒果苷后,不同时间点收集细胞并采用差速离心法分离INS-1细胞中的细胞器,细胞器中蛋白质浓度使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定,分离提取细胞浆、细胞核、线粒体。并且测定INS-1细胞中各细胞器分布芒果苷的含量。结果:1.在INS-1细胞中,芒果苷在2～500 ng·mL-1(r=0.9965)浓度范围内线性关系良好,日内、日间相对标准偏差RSI)均≤14.49%,准确度在93.97%～103.54%之间,提取回收率为86.32%～95.13%,基质效应为103.60%～1 14.68%。2.芒果苷在INS-1细胞内药代动力学研究:芒果苷单体50、100、500 μ mol·L-1单次给药INS-1细胞后,AUC(0-1)和Cmax随给药剂量的增加而增加。低中高剂量AUC(0-1)分别为 1501.58±309.05、2188.05±499.53、13215.58±907.81 ng·h·mL-1,经剂量校正后(AUC(0-1)/Dose)方差分析,低、中剂量组间有显著性差异(P<0.01),其他剂量组间无显著性差异(P>0.05)。Cmax分别为55.30±33.58、103.35±42.47、458.33±80.03 ng·mL-1,剂量校正后(C,x/Dose)经方差分析,三个剂量组间无显著性差异(P>0.05),表明Cmax随剂量升高而成比例升高。同一剂量芒果苷(100 μ mol·L-1)给药时,正常和模型组INS-1细胞主要药动学参数Cmax分别为454.83±45.46、334.00±35.06 ng·mL-1,AUC(0-1)分别为 13289.23±1080.58、9349.89±1101.36 ng·h·m L-1。Cmax和AUC(0-1)显低于正常组INS-1细胞,而半衰期T1/2z则明显延长,表明芒果苷在病理模型INS-1细胞中药代动力学发生明显变化。单次给药INS-1细胞芒果苷单体后,细胞内芒果苷Cmax较小,但吸收比较快;给药知母后,芒果苷Cmax和AUC(0-t),比芒果苷单体有升高,但差异均无统计学意义;知母配伍黄柏后,芒果苷在INS-1细胞内Cmax和AUC(0-t)比芒果苷单体组明显升高(P<0.01),Cmax较知母组也有所增加,但无统计学意义(P>0.05);AUC(0-t)较知母组明显增加(P<0.01)。单次给药INS-1细胞芒果苷单体、知母、知母-黄柏后,芒果苷在INS-1细胞内AUC(0-t)分别为200.34±57.99、293.00±96.68、480.69±74.69 ng·h·mL-1,Cmax分别为16.06±4.86、25.57±6.48、30.12 ± 7.64 ng·mL-1。3.芒果苷在INS-1细胞中各细胞器的分布:细胞器分离采用传统的差速离心法进行,测得线粒体中芒果苷AUC(0-t)最少,在模型组中有所提高,仍是分布最少的细胞器;芒果苷在正常组中细胞核内随着时间的增加而增加,在模型组中含量则先增加后减少且含量低于细胞浆。正常组线粒体、细胞核、细胞浆Cmax分别为3.76±0.40、133.98±35.12、126.83±17.82 ng·mL-1,AUC(0-t)分别为163.8±12.55、2905.62±533.23、2268.21 ± 110.23 ng·h·mL-1,Tmax分别为 24.42、48.00、4.00 h,模型组线粒体、细胞核、细胞浆Cmax分别为 31.65±4.51、68.13±21.68、180.83±85.27 ng·mL-1,AUC(0-t)分别为 674.35±162.82、1341.83±45.00、3622.43±794.69 ng·h·mL-1,Tmax分别为 8.00,7.00,6.33 h。结论:1.本文建立了快速、准确、可靠、适用于测定细胞样品芒果干浓度的LC-MS/MS法,并且满足方法学的分析要求。2.芒果苷在INS-1细胞药代动力学的剂量关系:正常INS-1细胞给药低中高剂量芒果苷单体后,芒果苷的Cmax和AUC(0-t)与剂量呈正相关,随着剂量的增大,Cmax和AUC(0-t)也呈增加趋势;等剂量给药芒果苷后,模型组INS-1细胞Cmax和AUC(0-1)明显低于正常组INS-1细胞(P<0.01),提示氧化损伤的INS-1细胞对芒果苷的吸收明显减少,而半衰期T1/2z亦明显降低(P<0.05),表明芒果苷在氧化损伤模型INS-1细胞中药代动力学发生变化;知母单煎液组中芒果苷在细胞中分布含量高于单体组,知母配伍黄柏给药后,芒果苷在INS-1细胞中的含量较单体组明显增加(P<0.01),AUC(0-t)较知母也明显提高(P<0.01),Cmax较知母组有所增加,但差异无统一学意义(P>0.05)。3.芒果苷在JNS-1细胞各细胞器的分布:在正常组中细胞核内随着时间的增加而增加,芒果苷在细胞浆中浓度快速上升,4 h达到Cmax,随后开始下降,线粒体的含量最低,Cmax和AUC0-t大小顺序为线粒体<细胞浆<细胞核,提示在正常组芒果苷主要分布于细胞核;与正常组相比,氧化损伤组芒果苷在细胞核的Cmax和AUC0-t明显下降,线粒体和胞浆的Cmax和AUC0-t则明显升高,Cmax和AUC0-t由小到大的顺序为线粒体<细胞核<细胞浆,提示在氧化损伤组芒果苷主要分布于细胞浆。表明氧化损伤状态下芒果苷在细胞器的分布发生明显变化。