血管损伤后,血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的生物学行为经历一系列的改变,包括表型转换、异常增殖和迁移、基质合成和炎症。血管平滑肌细胞的这些变化对血管重塑相关疾病,如动脉粥样硬化、高血压和血管成形术后再狭窄等的发生和发展至关重要。血管平滑肌在血管重塑过程中起着协调炎症、增生、分化和氧化应激的作用。尽管血管平滑肌细胞增殖、炎症和氧化应激等方面的病理生理机制已有报道,但是平滑肌细胞如何对损伤进行应答并协调这些复杂的反应过程,目前仍不清楚。micro RNA(mi RNA)是一类非编码小RNA,通过促进m RNA降解或抑制m RNA翻译而在转录后水平上调控基因表达。研究证实,多种mi RNAs在血管炎症和重塑中发挥重要作用。mi R-155是一种新近发现的炎症相关mi RNA,通过靶向多种炎症相关基因发挥促炎或者抗炎的作用。我们之前的研究发现,mi R-155参与颈动脉结扎后新生内膜的形成。然而,作为一个典型的、多功能的mi RNA,mi R-155在协调炎症、氧化应激中的作用尚不清楚。哺乳动物Ste20样激酶2(mammalian sterile 20–like kinase 2,MST2)作为Hippo通路的核心组件,在调节细胞增殖、生长和细胞凋亡过程中发挥重要作用。研究报道,RASSF1A与MST2结合形成二聚体后MST2活化,而Raf-1与MST2结合后,阻碍RASSF1A与MST2结合和二聚体的形成。MST2可结合到Raf-1的两个不同位点上,其中一个位点也是MEK与Raf-1的结合位点,这表明MST2可与MEK竞争性地与Raf-1结合进而调节ERK1/2信号通路。大量研究已经表明,MST2在激活丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和调节Raf-1/ERK通路中发挥重要作用,但MST2在调节炎症和氧化应激方面的作用尚无报道。因此,本研究利用小鼠股动脉损伤诱导的血管内膜增生模型,探讨MST2在mi R-155介导的炎症和氧化应激发生发展中的作用,旨在为阐明mi R-155在血管重塑中的作用机制以及药物开发研究提供实验基础。第一部分mi R-155促进血管平滑肌细胞增殖和血管内膜增生目的:探讨mi R-155对血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响及其在新生内膜形成中的作用。方法:1过表达或敲低血管平滑肌细胞中的mi R-155,Western blot检测增殖标志基因,细胞计数、MTS测定细胞增殖。2对mi R-155基因敲除(mi R-155-/-)小鼠和野生型(WT)小鼠进行右则股动脉导丝损伤。苏木精-伊红染色(HE)观察和评价内膜增生的形态学改变。3实时定量PCR(q RT-PCR)检测WT及mi R-155-/-鼠股动脉损伤前后mi R-155的表达。4野生型小鼠股动脉损伤后原位过表达mi R-155、原位转染mi R-155激动剂及抑制剂,HE染色验证内膜增生的形态学改变。5 SM22α联合MAC2免疫双荧光染色观察平滑肌细胞增殖和巨噬细胞浸润。6 SM22α联合mi R-155荧光探针原位杂交定位mi R-155的表达。7 TUNEL染色和Western blot检测过表达mi R-155对血管平滑肌细胞凋亡的影响。结果：1过表达和敲低mi R-155分别促进或抑制体外培养的血管平滑肌细胞增殖与对照组相比,过表达mi R-155促进细胞增殖核抗原(PCNA)的表达,增加细胞数和A490吸光值。相反,mi R-155抑制物处理后,血管平滑肌细胞的PCNA表达显著下调,细胞数量减少,A490吸光值降低。PDGF-BB处理血管平滑肌细胞促进mi R-155表达。说明过表达mi R-155促进而敲低抑制血管平滑肌的增殖。2 mi R-155遗传性缺失显著抑制导丝损伤所诱导的血管内膜增生HE染色结果显示,与对照组相比,股动脉内膜经导丝损伤后内膜增生显著;与野生型(WT)C57BL/6小鼠相比,遗传敲除mi R-155(mi R-155-/-)小鼠新生内膜形成、内膜中膜比(I/M)值和血管狭窄率显著降低。实时定量PCR结果显示,导丝损伤后血管壁mi R-155的表达增加约3.5倍,mi R-155-/-小鼠几乎检测不到mi R-155的表达。3原位过表达mi R-155促进导丝损伤所诱导的血管内膜增生WT小鼠股动脉经导丝损伤后原位给予Ad-mi R-155(或Ad-GFP,PBS)处理,术后14天RT-PCR检测mi R-155的表达,组织形态学检测内膜增生程度。结果显示,与对照组(Ad-GFP)相比,原位给予Ad-mi R-155的小鼠血管壁中mi R-155的表达显著增加(P<0.01),血管内膜增生显著,内膜中膜比值和血管狭窄率增加。4原位转染mi R-155激动剂促进、转染抑制剂减少导丝损伤所诱导的血管内膜增生为了排除单一遗传背景或病毒过表达对内膜增生的影响,我们又在导丝损伤后原位转染mi RNA(mi R-155 agomir,control agomir,mi R-155antagomir和control antagomir)分别过表达和敲低mi R-155。HE染色结果显示,与无靶点的RNA激动剂相比,mi R-155激动剂显著增加新生内膜形成、内膜中膜比值和血管狭窄率;相反,与无靶点的RNA拮抗剂相比,mi R-155拮抗剂显著降低内膜增生、内膜中膜比值和狭窄率。证明mi R-155在股动脉导丝损伤后新生内膜形成过程中起着重要作用。5在损伤的血管中mi R-155主要来源于平滑肌细胞平滑肌细胞增殖和巨噬细胞浸润是新生内膜形成的主要病理特征,因此我们想了解新生内膜形成过程中这两种细胞的变化情况。SM22α和MAC2免疫双荧光结果显示,WT小鼠的新生内膜内中SM22α阳性细胞占73.9%,而mi R-155-/-小鼠中仅占23.7%。然而,损伤区域的巨噬细胞数目(MAC2阳性细胞)在WT和mi R-155-/-小鼠之间并没有显著的差异。mi R-155荧光探针结合SM22α免疫染色的原位杂交结果显示,mi R-155的表达主要在血管平滑肌细胞中,而非新生内膜中的巨噬细胞。结果表明,mi R-155介导血管平滑肌细胞增殖,从而导致血管损伤后新生内膜的形成。6过表达mi R-155抑制H2O2诱导的血管平滑肌凋亡血管平滑肌细胞经H2O2处理后TUNEL染色阳性细胞显著增加;然而转染Ad-mi R-155后再给予H2O2,与Ad-GFP对照组相比,过表达mi R-155组TUNEL阳性细胞数显著下降。同时过表达mi R-155显著抑制caspase-3的活化。表明过表达mi R-155能抑制H2O2诱导的血管平滑肌凋亡。小结：mi R-155促进体外培养的血管平滑肌细胞增殖和抑制由H2O2诱导的细胞凋亡;遗传敲除mi R-155显著降低导丝损伤诱导的血管内膜增生;mi R-155功能获得或缺失实验均证实mi R-155在血管平滑肌细胞增殖和新生内膜形成中发挥至关重要的作用。第二部分mi R-155通过靶向抑制MST2促进炎症和氧化应激,导致血管平滑肌细胞增殖和重塑目的:揭示mi R-155通过靶向抑制MST2进而促进炎症和氧化应激反应及导致血管平滑肌细胞增殖和血管重塑的作用机制。方法:1通过mi Randa和RNAhybrid两网站对细胞增殖和迁移相关基因进行预测。2合成靶基因3’非编码序列(UTR)及其突变体并连接到pmir-GLO双荧光报告质粒中,转染293A细胞并进行双荧光报告基因活性检测。3血管平滑肌细胞中过表达或敲低mi R-155,Western blot检测MST2和TRIM39的表达。4对WT和mi R-155-/-小鼠股动脉导丝损伤组织进行MST2和SM22α免疫双荧光染色。5 q RT-PCR检测损伤组织中炎症和氧化应激相关基因的表达。6在血管平滑肌细胞中过表达mi R-155的同时过表达MST2,检测MST2介导mi R-155对血管平滑肌细胞增殖的影响。结果：1在血管平滑肌细胞中MST2是mi R-155的直接靶基因选取8个mi R-155的潜在靶基因进行荧光报告基因检测,结果显示,含有MST2、TRIM39和Itch的c DNA 3’UTR序列的报告基因能被mi R-155模拟物抑制。进一步的研究显示,与转染对照mi RNA相比,转染mi R-155模拟物后,含有MST2或TRIM39野生型3’UTR序列报告基因的活性显著降低,而mi R-155模拟物对含突变型3’UTR的报告基因几乎没影响。Western blot显示,在anti-mi R-155处理的细胞中,MST2蛋白质的表达呈剂量依赖性增加,而TRIM39蛋白表达没有明显的变化。相反,在血管平滑肌细胞中过表达mi R-155后,随着病毒剂量的递增,MST2蛋白质的表达逐渐下降,而TRIM39蛋白表达没有明显变化。2 mi R-155靶向抑制MST2促进血管平滑肌细胞的增殖与迁移q RT-PCR和Western blot结果均显示,mi R-155-/-小鼠的血管新生内膜中MST2表达显著高于野生鼠,而在原位过表达Ad-mi R-155的小鼠MST2表达显著低于对照组。用SM22α和MST2抗体进行免疫双荧光染色得到同样的结果。细胞划痕实验显示,过表达mi R-155显著增加血管平滑肌细胞的增殖和迁移活性,然而,当过表达mi R-155的同时也过表达MST2时,mi R-155促平滑肌细胞增殖和迁移的能力被消除。结果说明,mi R-155靶向抑制MST2在体内外均可促进血管平滑肌细胞的增殖与迁移。3 mi R-155靶向抑制MST2促进NF-κB、TNF-α、p47phox和HO-1表达q RT-PCR检测不同遗传背景或原位过表达mi R-155小鼠的损伤血管中炎症和氧化应激相关基因的表达。结果显示,i NOS、HO-1、p47phox和NF-κB的m RNA表达水平在mi R-155-/-小鼠显著低于野生型。相反,与原位转染Ad-GFP组相比,原位过表达mi R-155后,这些基因的表达活性显著提高。ELISA结果显示,TNF-α水平在mi R-155-/-组显著低于野生型组,而原位过表达mi R-155后,其表达水平明显提高,但IL-1β的蛋白表达水平没有明显变化。小结：mi R-155通过靶向抑制MST2促进炎症和氧化应激相关基因表达,进而导致血管平滑肌细胞的增殖、迁移和血管重塑。第三部分mi R-155通过靶向抑制MST2进而激活Raf-1-MEK-ERK1/2信号途径及整合炎症和氧化应激反应目的:探索mi R-155通过靶向抑制MST2从而调节炎症和氧化应激相关基因表达及平滑肌细胞增殖的信号传导途径。方法:1分别在血管平滑肌细胞中过表达或敲低mi R-155,Western blot检测与细胞增殖相关的信号通路及炎症和氧化应激相关基因表达。2用si RNA敲低内源性MST2,检测细胞增殖相关的信号通路、炎症和氧化应激相关基因表达。3过表达mi R-155的同时敲低MST2,或抑制mi R-155的同时敲低MST2,Western blot检测与细胞增殖相关的信号通路、炎症和氧化应激相关基因表达。4敲低内源性MST2后,分别用不同信号通路特异性抑制剂处理细胞,Western blot检测与细胞增殖相关的信号通路、炎症和氧化应激相关基因表达。5在血管平滑肌细胞中分别过表达或敲低mi R-155后,免疫共沉淀检测MST2、MEK、Raf-1相互作用。6报告基因检测NF-κB对mi R-155启动子活性的影响。7 q RT-PCR检测损伤血管组织中PDGF m RNA的表达水平。结果：1 mi R-155通过靶向抑制MST2而活化细胞增殖相关信号途径ERK1/2在血管平滑肌细胞中分别过表达或敲低mi R-155,Western blot检测与细胞增殖相关的信号通路。结果显示,过表达mi R-155显著下调MST2表达并增加PI3K/Akt和ERK1/2的磷酸化,但不影响JNK和p38的磷酸化。相反,与转染对照mi RNA相比,血管平滑肌细胞转染anti-mi R-155后,ERK1/2的磷酸化水平显著下降;然而,PI3K/Akt、JNK和p38的磷酸化水平没有明显的改变。Western blot结果显示,在同时敲低MST2和mi R-155的细胞中,ERK1/2的磷酸化水平升高,PI3K/Akt的磷酸化水平没影响,PCNA蛋白水平增加。与单纯过表达mi R-155相比,当在血管平滑肌细胞中过表达mi R-155的同时敲低MST2时,ERK1/2的磷酸化水平进一步增加。这些结果表明,mi R-155通过靶向抑制MST2而活化ERK1/2信号途径,进而促进血管平滑肌细胞的增殖。2 mi R-155通过靶向抑制MST2表达整合炎症和氧化应激反应Western blot结果显示,在血管平滑肌细胞中过表达mi R-155可促进p47phox和NF-κB表达;与此相反,敲低mi R-155下调这些蛋白质的表达。单纯敲低MST2使p47phox和NF-κB总蛋白及其磷酸化水平升高,但同时敲低MST2和mi R-155时,则下调这些蛋白质的水平。相反,单纯过表达MST2使p47phox和NF-κB总蛋白及其磷酸化水平降低,但过表达MST2的同时也过表达mi R-155时,又恢复了这些蛋白质的表达水平。这些结果表明,mi R-155通过MST2来调节p47phox和NF-κB的表达,MST2将炎症和氧化应激反应整合在一起。3 MST2通过Raf-1-MEK-ERK1/2信号通路促进mi R-155介导的炎症和氧化应激反应在血管平滑肌细胞中敲低MST2的同时,分别用PI3K/Akt、ERK1/2、NF-κB、和NAD(P)H信号通路抑制剂LY294002、PD98059、CAY10576和APOCYNIN处理细胞,结果显示,阻断ERK1/2信号通路后抑制了MST2敲低诱导的p47phox和NF-κB磷酸化。有趣的是,在血管平滑肌细胞中敲低MST2后再用CAY10576阻断NF-κB信号途径反而降低了p47phox的磷酸化水平。与此相一致的是,用APOCYNIN阻断NAD(P)H信号通路后也降低NF-κB的磷酸化水平。在血管平滑肌细胞中过表达mi R-155后进行免疫共沉淀分析的结果表明,与对照组相比,过表达mi R-155显著增加Raf-1免疫沉淀复合物中MEK水平,降低MST2水平。相反,mi R-155拮抗剂增加Raf-1免疫沉淀复合物中的MST2,减少MEK。mi R-155的过表达促进MEK和ERK/2磷酸化,而mi R-155拮抗剂抑制这两种信号转导分子的磷酸化。4 mi R-155、NF-κB和PDGF之间形成正反馈环路报告基因分析结果显示,与对照组相比,过表达NF-κB显著增加mi R-155/BIC启动子的活性。同时,在血管平滑肌细胞中过表达NF-κB后,也显著增加mi R-155基因的表达。对损伤的血管进行PDGF基因表达检测时发现,mi R-155-/-小鼠PDGF基因的表达水平显著低于野生型小鼠,与原位转染Ad-GFP组相比,原位过表达mi R-155能显著增加PDGF基因的表达水平。结论：mi R-155靶向抑制MST2,减少MST2与Raf-1的相互作用,使Raf-1与MEK结合增加,进而激活ERK1/2信号通路,并整合炎症和氧化应激反应。小结：1 mi R-155促进血管平滑肌细胞增殖和抑制细胞凋亡。2 mi R-155在血管平滑肌细胞增殖和新生内膜形成中发挥至关重要的作用。3在血管平滑肌细胞中MST2是mi R-155的直接靶基因。4 mi R-155通过靶向抑制MST2促进炎症和氧化应激相关基因表达,进而导致血管平滑肌细胞的增殖、迁移和血管重塑。5 mi R-155整合炎症和氧化应激反应是通过减少MST2与Raf-1的相互作用,增加Raf-1与MEK结合,进而激活ERK1/2信号通路。