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糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病常见的微血管并发症之一,约1/3的糖尿病患者会发展为糖尿病肾病,是导致糖尿病患者死亡的主要原因。微量蛋白尿是糖尿病肾病早期临床表现,目前研究认为,足细胞损伤在糖尿病肾病发病机制中发挥着重要的作用,与蛋白尿的发生密切相关。在糖尿病肾病研究中,足细胞损伤形式主要表现为足突脱落、足突融合、足细胞数目减少,进而导致肾小球硬化,形成蛋白尿等。但是有关糖尿病肾病时足细胞损伤的确切机制至今尚未完全阐明。Swiprosin-1/EFhd2是一种分子量为27k D的新型蛋白,2004年由瑞士科学家Vuadens F.等首次发现并报道。截至目前pubmed上检索仅有25篇相关文献报道,主要围绕其在T淋巴细胞、B淋巴细胞等免疫细胞中的分布、作用及相关功能的研究。我们课题组前期研究发现swiprosin-1/EFhd2表达在小鼠肾皮质中,而且发现其主要表达在肾小球足细胞中。进一步发现swiprosin-1/EFhd2在8周糖尿病模型小鼠肾皮质中表达上调。目前尚未见swiprosin-1/EFhd2在糖尿病肾病中作用的相关报道。我们前期研究发现敲除swiprosin-1/EFhd2后肾小球肥大程度减轻,基底膜增厚程度减弱,足细胞凋亡数目减少。因此,我们推测足细胞表达的swiprosin-1/EFhd2在糖尿病肾病的发生发展中发挥着重要作用。本课题围绕足细胞表达的swiprosin-1/EFhd2在糖尿病肾病发生、发展中的作用展开研究,并初步探讨其机制,从而为糖尿病肾病的治疗提供新靶点。方法与结果:一、Swiprosin-1/EFhd2在小鼠肾皮质中的表达及定位1.应用免疫印迹和免疫组化技术检测swiprosin-1/EFhd2在小鼠肾皮质中的表达和定位,发现swiprosin-1/EFhd2在肾小球中有适度表达。应用免疫荧光技术在小鼠肾皮质组织切片中标记swiprosin-1/EFhd2和足细胞特异标记物WT-1,发现WT-1标记的细胞表达swiprosin-1/EFhd2,即swiprosin-1/EFhd2表达在肾小球足细胞中。2.应用免疫印迹技术检测swiprosin-1/EFhd2在小鼠足细胞系MPC-5中的表达,免疫荧光技术标记MPC-5细胞中的swiprosin-1/EFhd2和nephrin,发现swiprosin-1/EFhd2在MPC-5中高表达,且与足细胞特异标记物nephrin共定位,主要分布在MPC-5的细胞浆以及细胞膜上。二、Swiprosin-1/EFhd2在糖尿病小鼠肾皮质中的表达变化给予C57小鼠腹腔注射链脲佐菌素,构建8周糖尿病模型小鼠,对照组小鼠注射等量枸橼酸钠缓冲液。72h后检测空腹血糖高于16.7 m M即确定为糖尿病,证明整体造模成功。1.应用免疫荧光和免疫印迹技术对模型组与对照组肾皮质中swiprosin-1/EFhd2含量进行检测,发现与对照组相比,糖尿病小鼠肾皮质中swiprosin-1/EFhd2蛋白表达水平显著增加。三、Swiprosin-1/EFhd2在足细胞MPC-5中的表达变化1.不同浓度高糖(5.5,11,22,33,44 m M)刺激MPC-5细胞48h后应用免疫印迹技术检测swiprosin-1/EFhd2的表达,发现随着高糖浓度的增加,swiprosin-1/EFhd2表达水平上升。与对照组相比,22,33,44 m M的浓度刺激swiprosin-1/EFhd2增加有统计学意义。2.33 m M的高糖刺激MPC-5细胞不同时间(12,24,48,72,96h)后,免疫印迹技术检测swiprosin-1/EFhd2的表达,发现随着高糖刺激时间的延长,swiprosin-1/EFhd2表达水平上升。与对照组相比,48,72,96h的高糖刺激后swiprosin-1/EFhd2增加有统计学意义。四、敲除Swiprosin-1/EFhd2对于早期糖尿病肾病发展的影响分别给予swiprosin-1+/+和swiprosin-1-/-小鼠腹腔注射链脲佐菌素,72h后检测空腹血糖高于16.7 m M即确定为糖尿病,构建糖尿病模型小鼠,为KO模型组和WT模型组。给予swiprosin-1+/+和swiprosin-1-/-小鼠注射等量枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液,分别为WT对照组和KO对照组。1.取小鼠肾组织切片应用HE染色、PAS染色观察肾小球损伤情况,发现KO模型组较WT模型组肾小球肥大程度减轻,基底膜增厚程度减弱,细胞质基质纤维化程度减少;2.将小鼠体重、肾重比进行记录、比较,发现KO模型组较WT模型组体重上升,肾重比下降;3.应用血糖测试仪检测小鼠血糖,结果显示KO模型组较WT模型组血糖水平低;4.收集小鼠尿液,应用酶联免疫吸附测定方法检测尿蛋白和胱抑素C含量,发现KO模型组较WT模型组尿蛋白水平下降,胱抑素C含量上升;5.应用实时定量PCR技术检测小鼠肾皮质组织中collagen IV,TGF-β和fibronectin的m RNA表达水平,发现KO模型组较WT模型组collagen IV,TGF-β和fibronectin的m RNA水平下调。五、干扰/过表达Swiprosin-1/EFhd2对于高糖刺激下足细胞的影响1.分别以swiprosin-1/EFhd2的si RNA干扰片段和对照片段转染MPC-5细胞,前者干扰swiprosin-1/EFhd2表达,作为模型组,后者作为对照组。给予高糖刺激48h后,应用流式细胞术和JC-1线粒体膜电位试剂盒检测细胞凋亡水平,结果显示干扰swiprosin-1/EFhd2后足细胞的凋亡水平显著下降。2.分别以swiprosin-1/EFhd2过表达慢病毒和对照慢病毒转染MPC-5细胞,前者过表达swiprosin-1/EFhd2,作为模型组,后者作为对照组。应用流式细胞术检测凋亡水平,结果显示过表达swiprosin-1/EFhd2后足细胞的凋亡水平显著上调,提示我们swiprosin-1/EFhd2具有促进凋亡的作用。六、Swiprosin-1/EFhd2影响糖尿病发展的作用机制1.取小鼠肾组织切片应用透射电镜观察肾小球损伤情况,发现KO模型组较WT模型组基底膜增厚程度减弱,足突融合、断裂、脱落情况显著减少,表明敲除swiprosin-1/EFhd2之后,足细胞损伤情况减弱;应用TUNEL染色法标记肾小球中凋亡的细胞,同时用免疫荧光技术标记足细胞,结果显示敲除swiprosin-1/EFhd2之后凋亡的足细胞减少。由此提示我们swiprosin-1/EFhd2可能参与足细胞的凋亡。2.在动物实验中,应用免疫印迹技术检测肾皮质中凋亡相关蛋白的表达,结果显示敲除swiprosin-1/EFhd2之后,促凋亡相关蛋白Bax、caspase3、caspase9表达减少,抑凋亡蛋白Bcl-2表达增加;细胞实验中,应用免疫印迹技术检测MPC-5细胞中凋亡相关蛋白的表达,结果显示干扰swiprosin-1/EFhd2之后,促凋亡相关蛋白Bax、caspase3、caspase9表达减少,抑凋亡蛋白Bcl-2表达增加,提示swiprosin-1/EFhd2可能参与足细胞中线粒体依赖的凋亡。3.在动物实验中,应用免疫印迹技术检测肾皮质中p38和ERK的磷酸化水平,结果显示敲除swiprosin-1/EFhd2之后,p38和ERK的磷酸化水平下降;在细胞实验中,应用免疫印迹技术检测MPC-5细胞中p38和ERK的磷酸化水平,结果显示干扰swiprosin-1/EFhd2之后,p38和ERK的磷酸化水平下降,提示swiprosin-1/EFhd2可能通过激活p38和ERK信号通路在糖尿病或高糖刺激下发挥作用。4.分别以p38和ERK的si RNA干扰片段及其相应的对照片段转染MPC-5细胞,给予高糖刺激48h后,应用流式细胞术检测细胞凋亡水平,结果显示干扰p38和ERK后足细胞的凋亡水平显著下降,验证了在高糖刺激下p38和ERK信号通路的激活对足细胞凋亡的促进作用。然后在过表达swiprosin-1/EFhd2的条件下,分别给予MPC-5细胞p38和ERK的si RNA片段干扰其表达,发现swiprosin-1/EFhd2过表达后足细胞的凋亡水平显著升高,但是干扰p38和ERK后足细胞的凋亡水平显著下降。由此我们再次验证了swiprosin-1/EFhd2的表达对足细胞凋亡过程的促进作用,且p38和ERK信号通路的介导在这一过程中起着重要作用。结论:1.足细胞在糖尿病和高糖刺激下高表达swiprosin-1/EFhd2,且随着浓度和时间增加,swiprosin-1/EFhd2表达增加;2.Swiprosin-1/EFhd2缺失可以减少早期糖尿病小鼠足细胞的凋亡;3.Swiprosin-1/EFhd2介导糖尿病和高糖刺激下线粒体依赖的足细胞凋亡;4.Swiprosin-1/EFhd2通过激活p38,ERK信号通路介导足细胞中线粒体依赖的凋亡。