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本文以自絮凝颗粒酵母——融合株SPSC为研究对象,通过开展细胞膜氨基酸组成与菌体耐酒精能力的关系、外源脂肪酸对酒精诱导细胞膜磷脂脂肪酸组成变化的影响、细胞膜磷脂脂肪酸组成对质膜ATP酶响应酒精刺激的影响、Mg2+和Ca2+影响菌体耐酒精能力的作用机制以及絮凝特性与菌体耐酒精能力的关系等方面研究,较系统探索菌体的耐酒精机制。 培养于添加和未添加三种氨基酸(异亮氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸,添加浓度分别为1.0、0.5和2.0 g/L)条件下的菌体于30℃经20%(v/v)酒精冲击9 h的存活率分别为57%和0。细胞膜氨基酸组成和膜流动性分析表明,所添加三种氨基酸是通过组入菌体细胞膜、改变膜的流动性从而显著提高菌体的耐酒精能力的,即当细胞膜氨基酸组成中异亮氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸含量明显增加时,菌体能有效抵抗高浓度酒精冲击引发的膜流动性的升高,从而维持膜的稳定。 培养于添加0.6mmol/L棕榈酸、亚油酸或亚麻酸不同条件下的菌体的细胞膜分别富含所添加的脂肪酸。存活率实验表明,细胞膜富含棕榈酸的菌体耐酒精能力明显高于细胞膜富含亚油酸或亚麻酸的菌体。细胞膜透性实验表明,细胞膜富含棕榈酸的菌体具有较强的耐酒精能力是与其在高浓度酒精冲击下可维持较低的膜透性密切相关的。然后,将菌体培养于同时添加脂肪酸(0.6 mmol/L)和酒精(3%-9%,v/v)条件下以进一步考察菌体细胞膜磷脂脂肪酸组成变化规律。与单独添加棕榈酸相比,同时添加酒精引起细胞膜磷脂棕榈酸含量明显增加,伴随9-十四碳烯酸、棕榈油酸和油酸含量明显减少;与单独添加亚油酸相比,同时添加酒精未引起细胞膜磷脂亚油酸含量明显增加,但引起油酸含量明显增加,伴随9-十四碳烯酸、棕榈油酸和棕榈酸含量减少;与单独添加亚麻酸相比,同时添加酒精引起细胞膜磷脂亚麻酸含量减少,伴随油酸含量显著增加,同时9-十四碳烯酸、棕榈油酸和棕榈酸含量减少。存活率实验证实,上述变化是菌体对酒精刺激的适应性响应,因为,与培养于仅添加脂肪酸条件下的菌体相比,培养于同时添加酒精条件下的菌体的耐酒精能力明显提高。同时,研究表明,棕榈酸和油酸都可通过加强细胞膜渗透屏障而提高融合株SPSC的耐酒精能力,这是饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸可提高同一菌株耐酒精能力的新的实验现象。 细胞膜磷脂脂肪酸组成对生长于未添加酒精条件下的菌体的质膜ATP酶活性(即酶的基态水平)没有影响,但却显著影响生长于添加酒精(1%-10%,v/v)条件下的菌体的质膜ATP酶对酒精激活的敏感性:预培养于添加0.6 mmol/L棕榈酸、亚油酸或亚麻酸条件下的菌体的质膜ATP酶的最大激活水平分别为各自酶的基态水平的3.6、1.5和1.2倍,而对照组(预培养于未添加脂肪酸条件下的菌体)的相应值为2.3倍。实验表明,细胞膜磷脂脂肪酸组成特点对菌体耐酒精能力的提高越有利,则其质膜ATP酶被酒精激活的幅度越大,表明菌体的耐酒精能力与其质膜ATP酶对酒精激活的敏感性密切相关。 生长和冲击阶段均添加3.5。比M扩+或1.64。1/Lc扩+都能显著提高菌体的耐酒精能力,但Mg2+的促进作用强于ca2+。通过考察Mg2+和c扩十对菌体于30℃在150/0(v/v)酒精冲击下细胞膜透性的影响发现,生长和冲击阶段均添加3.5。FL Mg2+或1.64ol几C扩+的菌体的膜透性系数(p’)分别仅为对照组水平的16%和29%,表明适当浓度的Mg2+或c扩十均能显著降低受冲击菌体的细胞膜透性,但Mg2+降低膜透性能力强于caz+;而且,实验显示,添加M扩+或c扩+提高存活率与添加Mg2+或c扩十降低尸存在直接的对应关系。因此,M犷+和c扩+提高菌体耐酒精能力均与各自降低受冲击菌体的细胞膜透性密切相关。 融合株SPSC与其两亲本粟酒裂殖酵母变异株和酿酒酵母变异株于30℃经18%(v/v)酒精冲击7h的存活率分别为52%、37%和9%。细胞膜磷脂脂肪酸组成分析表明,两絮凝酵母(融合株SPSC和粟酒裂殖酵母变异株)的棕搁酸含量均约为非絮凝酵母(酿酒酵母变异株)的两倍,而棕搁油酸和油酸的含量明显低于后者。实验表明,絮凝特性的存在是两絮凝酵母细胞膜棕搁酸含量升高的原因,而细胞膜棕搁酸含量增加是二者耐酒精能力强于酿酒酵母变异株的原因。絮凝特性提高菌体耐酒精性能是酵母菌耐酒精的一种新的机制。同时,研究表明,质膜ATP酶对维持细胞膜低通透性具有一定贡献,融合株SPSC耐酒精能力高于粟酒裂殖酵母变异株与其具有较高的质膜ATP酶活性有关。 综上所述,细胞膜透性在影响融合株SPSC耐酒精能力方面起着十分重要的作用,细胞膜磷脂脂肪酸组成、Mg2+、c扩十、絮凝特性和质膜ATp酶都会影响细胞膜透性从而影响菌体的耐酒精性能。