左旋多巴诱发异动症大鼠模型直接通路活化机制的研究

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第一部分:左旋多巴诱发异动症大鼠纹状体DARPP-32蛋白磷酸化状态的变化目的研究LID大鼠纹状体内DARPP-32蛋白磷酸化状态的变化,探讨LID时多巴胺D,受体介导的直接通路过度活化的机制。方法SD大鼠应用6-OHDA立体定位注射制备偏侧帕金森病大鼠模型,然后应用L-dopa治疗(10mg/kg,每天2次)28 d诱发LID大鼠模型。所有大鼠共分为对照组(接受同时程、同等剂量的L-dopa治疗,n=8),L-dopa治疗组(n=8)、LID组(n=8)。观察各组大鼠行为学变化,并采用逆转录聚合酶链式反应(reversetranscription polymerase chain reaction RT-PCR)及免疫印迹技术检测检测其纹状体内总DARPP-32的mRNA与蛋白表达及其Thr-34位点磷酸化水平。结果LID大鼠模型复制成功后出现了与人类LID相似的对侧上肢、躯干和口面部异常不自主运动(abnormal involuntary movement,AIM),并随L-dopa治疗时间的延长而加重。LID大鼠毁损侧Thr-34位点磷酸化的DARPP-32水平(1075.2±103.3)较对照组(198.7±49.5)及L-dopa治疗组(213.91±58.9)明显增高,差异均有显著性意义(P<0.01)。后两组中Thr-34位点磷酸化的DARPP-32水平无明显差异(P>0.05)。总DARPP-32 mRNA相对表达强度在对照组(1.10±0.26)、L-dopa治疗组(1.20±0.46)与LID组(1.02±0.24)之间无显著差异。总DARPP-32蛋白的表达在对照组(1308.8±120.1)、L-dopa治疗组(1401.5±132.3)与LID组(1387.1±120.2)之间亦无显著性差异(P>0.05)。结论DARPP-32的Thr-34位点的磷酸化水平的改变是LID时多巴胺D1受体介导的直接通路异常活化的关键因素之一。第二部分反义FoSB和反义CREB抑制左旋多巴诱发异动症大鼠前强啡肽原基因的表达目的探讨纹状体内转录调控因子FosB基因和CREB基因对LID大鼠PDynmRNA表达的影响。方法6-OHDA立体定位注射及慢性L-dopa治疗诱发LID大鼠模型,所有大鼠共分为对照组(n=10)、对照+反义FosB组(n=12)、对照+正义FosB组(n=13)、对照+反义CREB组(n=11)、对照+正义CREB组(n=13)、LID组(n=10)、LID+反义FosB组(n=9)、LID+正义FosB组(n=7)、LID+反义CREB组(n=8)、LID+正义CREB组(n=8)。对照组与LID组分别注射PBS,其余各组大鼠纹状体内分别注射相应反义、正义FosB和CREB。后5组大鼠进行AIM评分,并采用原位杂交方法观察大鼠纹状体内PDyn mRNA的变化。结果反义FosB治疗前后LID大鼠AIM评分分别为40.1±9.2、12.5±5.4,差异有统计学意义(P<0.01)。LID+反义FosB组损毁侧纹状体PDyn mRNA水平(0.2415±0.0220)较LID+正义FosB组损毁侧(0.4105±0.0386)显著降低(P<0.01)。对照+反义CREB组大鼠损毁侧纹状体PDyn mRNA水平(0.1775±0.0246)较对照+正义CREB组(0.2454±0.0243)明显降低(P<0.01)。反义CREB治疗前后LID大鼠AIM评分分别为40.5±10.0、43.2±11.8,无明显差异(P>0.05)。LID+反义CREB组损毁侧纹状体PDyn mRNA水平(0.2415±0.0220)与LID+正义CREB组(0.4087±0.0440)之间差异无显著性差异(P>0.05)。结论在LID大鼠中,FosB蛋白取代了CREB调控PDyn mRNA的表达,是发生LID的关键因素之一。第三部分MK-801对左旋多巴诱发异动症大鼠强啡肽原基因与DARPP-32蛋白表达的影响目的研究MK-801对LID大鼠纹状体内PDyn mRNA表达及DARPP-32蛋白磷酸化状态的影响。方法PD大鼠应用L-dopa治疗(10mg/kg,每天2次)28d诱发LID大鼠模型,于第29d L-dopa治疗前15min腹腔注射MK-801(0.1mg/kg)一次(n=8)。接受同时程、同等剂量的L-dopa治疗正常大鼠作为对照组(n=8)。采用原位杂交技术检测PDynmRNA水平及免疫印迹技术检测LID大鼠纹状体内DARPP-32的Thr-34位点磷酸化水平的变化。结果MK-801组大鼠刻板动作明显减少,AIM评分(5.9±3.1)较与LID组(40.8±10.5)比较有极显著统计学差异(P<0.01)。MK-801治疗组大鼠PDyn mRNA相对表达强度(0.2313±0.0568)较LID组(0.3662±0.0625)显著降低(P<0.05),与对照组(0.2085±0.0573)相比无明显差异(P>0.05)。MK-801治疗组大鼠Thr-34位点磷酸化的DARPP-32水平(239.1±45.2)较LID组(1075.2±103.3)亦显著下降,与对照组(198.7±49.5)相比无明显差异(P>0.05)。结论MK-801可以降低PDyn mRNA与Thr-34位点磷酸化的DARPP-32的表达。因此,MK-801可以减轻LID时多巴胺D1受体介导的直接通路异常活化状态。
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