论文部分内容阅读
家蚕是鳞翅目昆虫的重要模式生物之一,同时也是重要的泌丝经济昆虫。丝腺是家蚕幼虫特有的泌丝器官。家蚕丝腺细胞只在胚胎期发生约10次有丝分裂,继而形成形态学上和功能学上可划分的前部丝腺、中部丝腺和后部丝腺,共形成约1080个细胞。自此直到幼虫期结束,丝腺细胞不再发生有丝分裂,只进行DNA复制和细胞体积增大的特殊核内有丝分裂。在幼虫期,丝腺细胞内基因组含量增加约40万倍,到五龄时丝腺细胞核几乎布满了整个胞质区域,使得细胞核与细胞质充分接触,大大增加了核质间的物质交流,为家蚕在吐丝期快速而又大规模的合成丝蛋白提供了极为有利的条件。随着家蚕全基因组和转录组测序的完成,许多研究学者再次把目光聚焦到家蚕丝蛋白合成的机制上。家蚕丝蛋白合成的前提是其丝腺细胞高效的核内有丝分裂,然而丝腺细胞高效核内有丝分裂的调控机制尚不清楚。家蚕丝腺细胞发生核内有丝分裂的时间跨度和DNA复制效率在自然界已知的生物中是最特异和高效的,阐明丝腺细胞高效核内有丝分裂的调控机制,可为提高家蚕丝产量和蚕业发展提供重要理论依据,也可望为完善细胞周期调控机制提供重要线索。本研究首先对家蚕幼虫期丝腺细胞核内DNA复制变化的趋势进行了详细分析；然后鉴定了蜕皮激素、保幼激素、营养、胰岛素对丝腺细胞DNA复制的影响,进一步阐明了影响丝腺细胞核内有丝分裂的生理因素,并探究其调控机制,为解析家蚕幼虫丝腺细胞核内有丝分裂的调控机制奠定了重要基础。主要研究结果和结论如下：1.家蚕幼虫期丝腺细胞核内DNA复制情况通过BrdU标记方法结合组织免疫荧光技术,对家蚕幼虫期丝腺细胞DNA复制情况进行详细分析。研究结果发现,家蚕幼虫期丝腺细胞DNA复制呈波动趋势,在刚蜕皮即眠起时有自激发现象,自此到盛食期被逐渐激发,且在盛食期达到最高,将眠时被逐渐抑制,在眠期达到最低。随着龄期的推进DNA复制程度越来越高,在五龄三天时DNA复制活性达到最高,且在五龄末期后部丝腺细胞先停止DNA复制,随后是中部丝腺和前部丝腺细胞。另外,利用荧光定量PCR对细胞周期相关基因在家蚕幼虫期丝腺中的表达情况进行分析,结果显示细胞周期相关基因在丝腺中的表达变化与家蚕幼虫期丝腺细胞DNA复制的波动趋势基本一致。家蚕幼虫期丝腺细胞DNA复制的这种变化趋势,表明丝腺细胞DNA复制与调控家蚕幼虫发育的因素相关。因此,我们推测蜕皮激素、保幼激素和营养可能参与调控丝腺细胞核内有丝分裂。2.激素和饥饿对丝腺细胞核内有丝分裂的调控研究我们选择家蚕四龄幼虫作为激素和饥饿处理的材料,通过体内注射和体外培养方法结合BrdU标记技术,发现体内注射蜕皮激素(20E)后丝腺细胞DNA复制被逐渐抑制,体外培养添加20E后丝腺细胞DNA复制没有变化：无论体内注射还是体外培养处理,保幼激素(JH)对丝腺细胞DNA复制都没有影响,表明JH不能激发丝腺细胞DNA复制。以上研究结果表明在家蚕幼虫体内20E能抑制丝腺细胞DNA复制,说明在家蚕幼虫将眠和眠期时丝腺细胞DNA复制被逐渐抑制受体内蜕皮激素的调控。饥饿处理后丝腺细胞DNA复制被抑制,重新喂食后又被激发,再饥饿后又被抑制,再次添食桑叶后丝腺细胞DNA复制重新被激发。饥饿处理后家蚕幼虫血淋巴中海藻糖和氨基酸的含量发生了变化。通过注射海藻糖、氨基酸、葡萄糖或三者混合物至饥饿处理后的家蚕幼虫体内,研究发现它们都不能重新激发丝腺细胞DNA复制,表明单一营养因子不能激发丝腺DNA复制。以上研究结果说明蜕皮间期丝腺细胞DNA复制被激发与家蚕幼虫大量进食桑叶有关。3.胰岛素信号对丝腺细胞核内有丝分裂的调控研究通过体内注射和体外培养方法结合BrdU标记技术,发现胰岛素能激发丝腺细胞DNA复制。通过体外培养添加信号通路特异抑制剂处理,发现PI3K信号通路、TOR信号通路和ERK信号通路都参与丝腺细胞DNA复制的调控。通过体外培养添加胰岛素和上述各信号通路抑制剂处理,再结合BrdU标记技术和Western Blot分析,发现PI3K信号通路和TOR信号通路协同介导胰岛素对家蚕幼虫丝腺细胞DNA复制的激发,且PI3K信号通路位于TOR信号通路的上游；胰岛素不能激发ERK信号通路,推测其可能受到其他因子的调控。另外,Western Blot分析结果表明体内注射20E处理和饥饿处理都能抑制P13K信号通路和TOR信号通路,说明胰岛素信号通路也参与20E和饥饿对家蚕幼虫丝腺细胞DNA复制的调控。4.定量蛋白组学分析家蚕幼虫眠期和盛食期丝腺组织差异表达蛋白我们利用iTRAQ标记方法结合质谱技术,鉴定了家蚕幼虫眠期和盛食期丝腺组织差异表达蛋白,共鉴定到蛋白4170个,差异蛋白181个,盛食期的与眠期的相比,上调蛋白71个,下调蛋白110个。对鉴定到的差异蛋白进行GO分析,发现分子功能注释中9个条目和生物学过程中19个条目发生了改变。将差异蛋白在KEGG数据库中进行Pathway显著性富集分析,发现这些差异蛋白富集到115个不同的生化途径和信号通路中,说明盛食期的丝腺细胞与眠期的相比其生理生化发生明显的改变；此外,37%的差异蛋白富集到脂类、碳水化合物等代谢通路当中,说明能量代谢相关途径也发生了明显的改变。我们进一步筛选了与细胞周期相关的15个信号通路,对富集到其中的差异表达基因进行了验证和分析,并对发生最显著差异的Pathway中差异倍数最大的基因(SilkDB ID:BGIBMGA005826)做了进一步研究。GO分析和KEGG Pathway富集分析显示,该基因参与脂类代谢,且与癌症发生相关。家蚕基因芯片数据分析和荧光定量PCR检测结果表明,该基因在家蚕五龄三天丝腺组织中特异高表达,并且在家蚕幼虫丝腺中的表达变化与丝腺细胞DNA复制波动趋势基本一致,因此,我们猜测该基因可能与丝腺细胞高效核内有丝分裂调控相关。结构域预测显示,该基因包含一个保守的昆虫类型的短链脱氢酶结构域(ADH_SDR_c_like),属于经典类型的短链脱氢酶超家族,在结构域上含有4个活性位点和19个NAD(P)结合位点,故将其命名为BmADH,推测其与能量代谢通路相关。然后,我们进一步对BmADH基因的功能进行了分析。免疫荧光检测结果显示BmADH基因定位于胞质中。在家蚕胚胎细胞系中干涉BmADH基因后能抑制TOR信号通路并抑制DNA复制。荧光定量PCR和免疫印迹检测结果表明,体内注射20E处理和饥饿处理后丝腺中BmADH基因的mRNA和蛋白表达水平均显著下调,说明BmADH基因的表达受到蜕皮激素和营养的调控。以上研究结果不仅从侧面验证了20E、饥饿和胰岛素信号对家蚕幼虫丝腺细胞核内DNA复制的调控,也为进一步研究丝腺细胞高效核内有丝分裂的调控机制提供了新的方向。