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目的：巨噬细胞是机体免疫系统的重要细胞群，由于所处的环境和活化状态不同其表型和功能各异。肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是肿瘤组织内浸润的一类主要白细胞群，相对于经典巨噬细胞TAM倾向于具有M2巨噬细胞的表型和功能。历经多年研究越来越清晰的发现，TAM可以通过分泌白细胞介素-10(IL-10)、转化生长因子-β(TGF-β)、血管内皮（细胞）生长因子（VEGF）、白细胞介素-8(IL-8)等细胞因子和基质金属蛋白酶(MMP)在肿瘤的进展、侵袭和免疫抑制中发挥了重要作用。在一些肿瘤模型研究中发现，很多由巨噬细胞介导的炎症反应是肿瘤细胞转移和发展的关键。相应的，在很多但不是全部人类肿瘤中，TAM的高浸润率与预后差相关，白细胞和淋巴瘤浸润相关的基因(如CD68)是淋巴瘤和乳腺癌的预后差的分子信号。反之，肿瘤细胞和肿瘤微环境也影响着TAM的极化和功能。
本课题通过在体外模拟肝癌组织中的肝癌细胞与浸润的巨噬细胞相互作用的微环境，检测体外培养环境中腹水型小鼠肝癌细胞对小鼠巨噬细胞增殖、分化的影响，以进一步探讨巨噬细胞的分化机制。
方法：
1、实验分组：H-22细胞培养上清液组：将小鼠RAW264.7巨噬细胞分别置于含25％、50％小鼠H-22肝癌细胞培养上清液的DMEM培养液中培养；H-22全细胞抗原组：小鼠RAW264.7巨噬细胞分别在含10％、20％的小鼠H-22肝癌细胞全细胞抗原上清液的DMEM培养液中培养；H-22细胞共培养组：小鼠H-22肝癌细胞和小鼠RAW264.7巨噬细胞分别按1：1、2：1在DMEM培养液中共培养；对照组：小鼠RAW264.7巨噬细胞在DMEM培养液中单独培养。
2、H-22细胞培养上清液制备：以2.5×105/ml的浓度接种H-22细胞于20mlDMEM培养液中，72小时后收集上清液离心、过滤除菌。H-22全细胞抗原上清液的制备：H-22细胞以5×106/支分装冻存管，液氮反复冻融3次后收集上清液离心、过滤除菌。
3、各组分别培养3天，5天时观察细胞形态变化。
4、MTT法检测RAW264.7巨噬细胞的增殖情况。
5、Real-time PCR检测RAW264.7巨噬细胞白细胞介素-6(IL-6)、IL-10、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、TGF-β等细胞因子的表达。
6、流式细胞术检测RAW264.7巨噬细胞表面CD80、CD86、MHC-Ⅱ的表达。
7、动物实验：将H-22肝癌细胞接种到小鼠腹腔中，7天后处死小鼠获取腹水和脾脏，腹水经培养纯化后得到腹腔巨噬细胞，Real-time PCR检测小鼠腹腔巨噬细胞及脾脏表达IL-6、IL-10、TNF-α的变化，流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞CD80、CD86、MHC-Ⅱ的表达情况。
结果：
1、倒置显微镜下形态观察：H-22全细胞抗原组和H-22细胞培养上清液组的RAW264.7巨噬细胞的生长情况基本相同，在培养3天时均出现体积变大，枝杈状突起改变，且有明显的浓度依赖关系，在H-22细胞共培养组中发现RAW264.7巨噬细胞有生长抑制现象。
2、MTT结果显示：培养3天时H-22细胞培养上清液组RAW264.7巨噬细胞的增殖明显高于对照组，H-22全细胞抗原组和H-22细胞共培养组与对照组比较增殖不明显。
3、Real-time-PCR结果显示，与对照组相比，H-22细胞培养上清液组的RAW264.7巨噬细胞的IL-6、IL-10、TNF-α表达水平升高，其中3天组IL-6和5天组IL-10升高明显，而TGF-β变化不明显；H-22全细胞抗原组的RAW264.7巨噬细胞IL-6、IL-10表达水平升高，其中IL-10升高明显，TGF-β的表达降低，而TNF-α水平变化不明显；H-22细胞共培养组的RAW264.7巨噬细胞IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β表达水平均降低，其中1：1浓度组降低明显。
4、流式细胞术结果显示：H-22细胞培养上清组RAW264.7巨噬细胞细胞表面CD80、CD86呈现低表达，而MHC-Ⅱ呈现高表达；H-22全细胞抗原组3天20％浓度组细胞表面CD86高表达，5天20％浓度组细胞表面CD80高表达，而MHC-Ⅱ均呈现高表达；H-22细胞共培养组CD80、CD86、MHC-Ⅱ均呈现高表达。
5、动物实验结果表明：与对照组比较，实验组小鼠腹腔巨噬细胞表达IL-6、IL-10水平升高；小鼠脾细胞表达IL-6、IL-10、TNF-α水平均降低，其中IL-6降低明显。流式细胞术结果显示，小鼠腹腔巨噬细胞CD80、CD86均呈现低表达，而MHC-Ⅱ变化不明显。
结论：
1、小鼠H-22肝癌细胞培养上清液中具有的成分能促进小鼠RAW264.7巨噬细胞增殖，并有诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞向M2巨噬细胞分化的倾向。
2、小鼠H-22肝癌细胞全细胞抗原上清液中具有的成分能刺激RAW264.7巨噬细胞活化，并有诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞向M1巨噬细胞分化的倾向。
3、H-22肝癌细胞的生长对巨噬细胞的增殖分化有抑制作用。
4、H-22肝癌细胞培养上清液能够使巨噬细胞表达协同刺激分子CD80CD86降低。