研究背景:目前,在我国城乡居民总死亡原因中,心血管病死亡分别占43.56%和45.91%,远远大于肿瘤和呼吸系统疾病导致的死亡。心衰是各种心血管疾病的终末阶段,而心肌肥厚是心血管疾病发展为心衰的关键环节。因此,改善心脏收缩功能和预防或逆转心肌肥厚是治疗心衰的有效手段。传统中药黄连中的有效成分小檗碱常被用于治疗胃肠道感染和细菌性痢疾等疾病。然而,近几十年来,小檗碱因其具有抗高血压、心肌肥厚、心衰和高血脂等多种心血管疾病的作用而得到广泛关注。临床研究报道,小檗碱可显著改善心衰患者的心脏射血功能。同时,小檗碱抗心肌肥厚的作用也在多种动物模型上得到了广泛的验证。因此,阐明小檗碱正性肌力和抗心肌肥厚的作用机制可促进小檗碱在临床上的应用。Ca2+是细胞中一种重要的第二信使。它既能参与兴奋收缩耦联（excitation-contraction coupling,ECC）信号通路调控心肌细胞收缩功能,又能在病理状态下通过Ca2+依赖的信号通路促进心肌肥厚的发生。小檗碱在生理和病理状态下均具有正性肌力作用,但其作用机制尚不明确。目前,对于该作用机制的研究往往局限于小檗碱对心肌细胞中游离Ca2+浓度或L-型Ca2+通道(L-type Ca2+channels,LTCCs)活性的影响。这些研究因为实验条件（如实验动物种属、生理溶液等）不同而往往无法得到一致的结论。此外,关于小檗碱抗心肌肥厚作用与钙调控的关系尚未见报道。本课题组前期研究表明,小檗碱不仅对健康大鼠离体心脏和左心室组织具有正性肌力作用,而且能够抑制高血压诱导的大鼠心肌肥厚。本课题延续前期研究,旨在探究生理状态下小檗碱对成年大鼠心肌细胞的钙调控机制和在病理状态下从钙调控角度阐明小檗碱抗心肌肥厚的作用机制。这将为临床上应用小檗碱预防和治疗心衰提供有力的理论依据,对心血管疾病的治疗具有深远的意义。研究目标:1.研究生理状态下小檗碱对大鼠左心室心肌细胞的钙调控机制;2.基于钙调控阐明小檗碱抗大鼠心肌肥厚的作用机制。研究方法和结果:1.生理状态下小檗碱对大鼠左心室心肌细胞中Ca2+浓度的影响方法:利用激光共聚焦显微镜和钙离子探针Fluo4-AM,检测小檗碱对成年大鼠左心室心肌细胞（adult rat left ventricular cardiomyocytes,ARCs）中Ca2+浓度的的影响。结果:（1）在静息状态下,30-300μM小檗碱显著增大ARCs中的荧光强度。（2）在电刺激条件（15 V,4 ms,1 Hz）下,100-300μM小檗碱显著增大ARCs钙瞬变最高点（peak）和基线（baseline）处的荧光强度。以上结果表明,小檗碱能够升高ARCs中Ca2+浓度。2.生理状态下小檗碱对大鼠左心室心肌细胞Ca2+内流的影响方法:（1）利用激光共聚焦显微镜和钙离子探针Fluo4-AM,结合无钙KH溶液探究Ca2+内流与小檗碱升高ARCs中Ca2+浓度的关系。（2）利用LTCCs抑制剂硝苯地平和激动剂FPL-64176,探究LTCCs介导的Ca2+内流与小檗碱升高ARCs中Ca2+浓度的关系。（3）利用低钠溶液或反向钠钙交换泵(Na+-Ca2+exchanger,NCX)抑制剂,探究反向NCX介导的Ca2+内流与小檗碱升高ARCs中Ca2+浓度的关系。（4）利用反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）技术和Western-blot技术,分别在m RNA和蛋白水平上检测小檗碱对相关离子通道基因表达水平的影响。结果:（1）在无钙KH溶液中,300μΜ小檗碱增大ARCs中荧光强度的作用被显著抑制（p<0.001）。（2）10μM硝苯地平对300μΜ小檗碱增大ARCs中荧光强度的作用无显著影响。先给予10μM FPL-64176后,ARCs中的荧光强度增大;随后,300μΜ小檗碱能够进一步增大ARCs中的荧光强度（p<0.001）。（3）低钠溶液、1 m M Ni Cl2和5μM KB-R7943均显著抑制300μM小檗碱升高ARCs中荧光强度的作用（p<0.001）。（4）30-300μM小檗碱对NCX1 m RNA和蛋白的表达水平无显著影响。以上结果表明,小檗碱可通过激活反向NCX促进Ca2+内流而升高ARCs中Ca2+浓度。3.生理状态下小檗碱对大鼠左心室心肌细胞内Ca2+释放的影响方法:（1）利用激光共聚焦显微镜和钙离子探针Fluo4-AM,检测小檗碱对ARCs的肌质网释放钙火花的影响。同时,利用雷尼丁受体（ryanodine receptor,Ry R）抑制剂丁卡因检测内钙释放与小檗碱升高ARCs中Ca2+浓度的关系。（2）利用蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）、Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/Ca M dependent kinaseⅡ,Ca MKⅡ)抑制剂（H-89和KN-93）检测小檗碱对Ry R活性的影响。（3）检测小檗碱对ARCs中肌质网钙含量的影响。（4）检测肌质网膜蛋白Ry R2和2a型肌质/内质网Ca2+ATP酶(sarco/endoplasmic reticulum Ca2+ATPase,type 2a isoform,SERCA2a)的表达水平。结果:（1）300μM小檗碱增大ARCs肌质网释放钙火花的总次数和频率,并显著增大钙火花的平均质量（p<0.01）。同时,1.5 m M丁卡因显著抑制300μM小檗碱增大ARCs中荧光强度的作用（p<0.001）。（2）3μM H-89和10μM KN-93均显著抑制300μM小檗碱增大ARCs中荧光强度的作用（p<0.001）。（3）300μM小檗碱显著增大ARCs中10 m M咖啡因引起的钙瞬变的振幅（p<0.001）和钙瞬变荧光强度-时间积分值（p<0.01）。（4）30-300μM小檗碱对Ry R2和SERCA2a的m RNA和蛋白表达水平均无显著影响。以上结果表明,小檗碱通过激活Ry R促进ARCs内钙释放。这一作用可能是通过增强PKA和Ca MKⅡ介导的磷酸化以及升高肌质网钙含量实现的。4.心肌肥厚状态下小檗碱对ECC信号通路相关基因表达水平的影响方法:（1）利用腹主动脉结扎术（abdominal artery banding,AAB）构建压力超负荷诱导的大鼠心肌肥厚模型。利用智能无创血压计和生物信号采集系统检测小檗碱对大鼠血压的影响。以心脏指数、心肌细胞间质胶原沉积、心肌细胞横截面积和心肌肥厚标志物利钠肽A（natriuretic peptide A,Nppa）和利钠肽B（natriuretic peptide B,Nppb）m RNA的表达水平评价小檗碱对大鼠心肌肥厚的影响。（2）利用去甲肾上腺素（norepinephrine,NE）和L-苯肾上腺素（L-phenylephrine,PE）刺激ARCs构建大鼠心肌细胞肥厚模型。以细胞表面积指数和心肌肥厚标志物Nppa和Nppb m RNA的表达水平评价小檗碱对ARCs肥厚的影响。（3）检测心肌肥厚状态下小檗碱对大鼠心脏左心室组织和ARCs中ECC信号通路相关基因SERCA2a、Ry R2和NCX1表达水平的影响。结果:（1）无创血压检测结果显示,80 mg/kg小檗碱显著降低AAB大鼠的收缩压和平均压（p<0.05）。右侧总颈动脉血压检测结果显示,80 mg/kg小檗碱显著降低AAB大鼠的收缩压（p<0.05）。（2）80 mg/kg小檗碱显著减小AAB大鼠的心脏指数、心肌细胞间质的胶原沉积、心肌细胞横截面积以及下调大鼠左心室组织中Nppa和Nppb m RNA的表达水平。（3）在1μM NE诱导的心肌细胞肥厚模型中,1、3μM小檗碱显著抑制1μM NE增大ARCs表面积指数的作用。在10μM PE诱导的心肌细胞肥厚模型中,3、6μM小檗碱显著抑制10μM PE增大ARCs表面积指数的作用。1、3和6μM小檗碱单独给药对ARCs表面积指数无显著影响。RT-PCR结果显示,3μM小檗碱显著抑制10μM PE上调ARCs中Nppa和Nppb m RNA表达水平的作用（p<0.01,p<0.05）。（4）体内实验结果显示,AAB组大鼠左心室组织中SERCA2a和Ry R2 m RNA和蛋白水平分别出现下调和上调,但均不具有显著性;给药24周后,80 mg/kg小檗碱对此无显著影响。各组中NCX1m RNA和蛋白的表达水平均无显著差异。体外实验结果显示,溶媒组、10μM PE给药组和3μΜ小檗碱+10μM PE给药组ARCs中SERCA2a m RNA的表达水平无显著差异。10μM PE下调ARCs中Ry R2 m RNA的表达水平,但无显著性;给药24 h后,3μM小檗碱对此无显著影响。10μM PE上调ARCs中NCX1 m RNA的表达水平,但无显著性;给药24 h后,3μM小檗碱显著抑制10μM PE上调ARCs中NCX1 m RNA表达水平的作用（p<0.05）。在蛋白水平上,10μM PE显著上调ARCs中SERCA2a和Ry R2的表达水平（p<0.05）;给药24 h后,3μM小檗碱对此无显著影响。NCX1的蛋白表达水平在各组中均无显著差异。以上结果表明,小檗碱在体内外均具有抗心肌肥厚的作用,但该作用不是通过调控ECC信号通路相关基因的表达实现的。5.心肌肥厚状态下小檗碱对STIM1表达水平和STIM1依赖的SOCE的影响方法:（1）利用RT-PCR技术和Western-blot技术,分别在m RNA和蛋白水平上检测心肌肥厚状态下小檗碱对大鼠左心室组织和ARCs中1型基质相互作用分子（stromal interaction molecule 1,STIM1）表达水平的影响。（2）利用激光共聚焦显微镜和钙离子探针Fluo4-AM,检测心肌肥厚状态下小檗碱对ARCs中STIM1依赖的SOCE的影响。结果:（1）心肌肥厚状态下,小檗碱在体内外对STIM1 m RNA的表达水平均无显著影响,但能够显著降低STIM1蛋白的表达水平。（2）10μM PE显著增强ARCs中的SOCE（p<0.001）;给药24 h后,3μM小檗碱显著抑制ARCs中10μM PE增强的SOCE（p<0.001）。以上结果表明,小檗碱抗心肌肥厚的作用是通过下调STIM1蛋白的表达水平,并减小STIM1依赖的SOCE实现的。结论:1.在生理状态下,小檗碱通过激活ARCs中反向NCX和Ry R分别促进细胞外Ca2+内流和肌质网内Ca2+释放,最终升高ARCs中的Ca2+浓度。其中,小檗碱激活Ry R的机制可能与增强PKA、Ca MKⅡ介导的Ry R磷酸化和增大肌质网的钙含量有关。2.在心肌肥厚状态下,小檗碱通过降低STIM1的蛋白表达水平并减小STIM1依赖的SOCE发挥抗大鼠心肌肥厚的作用。该作用不是通过调控ECC信号通路相关基因的表达实现的。