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乳酸菌是益生菌的重要成员,具有促进营养吸收、拮抗致病菌黏附定植、增强宿主免疫力和维持肠道稳态等重要生理功能。黏附定植于肠上皮细胞是乳酸菌发挥益生功能的基础,亦是拮抗致病菌内化、定植肠道的前提。目前,乳酸菌功能性组分及其作用分子机制研究甚少。乳酸菌的表面蛋白是其与外界直接接触的物质,具有抑制致病菌内化定植、调节宿主免疫等多种生理特性。因此,阐明乳酸菌表面蛋白在拮抗致病菌黏附、内化和定植的内在机制,将为丰富挖掘益生菌表面蛋白在调节胃肠道微生态及其机体免疫作用,提供重要科学依据。本文借助细胞和动物模型,较为系统地探究了屎肠球菌WEFA23表面蛋白拮抗单核增生李斯特菌内化定植分子机制,并借助分子生物学手段构建其表面蛋白主要成分鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ornithine carbamoyltransferase,OTC)基因缺陷株,为功能实验验证提供基础材料。第一章绪论部分在阐述乳酸菌表面蛋白、单核增生李斯特菌以及基因重组技术的基础上,对肠球菌拮抗单核增生李斯特菌的研究动态进行了简述,对屎肠球菌WEFA23的表面蛋白拮抗单核增生李斯特菌的内化定植分子机制进行了展望。第二章探究了屎肠球菌WEFA23表面蛋白抑制单核增生李斯特菌内化肠上皮细胞机制。结果显示,50-200 μg/mL的表面蛋白对Caco-2细胞无毒性,浓度高于100 μg/mL的表面蛋白可通过排斥方式,显著拮抗单核增生李斯特菌内化Caco-2细胞(P<0.05),200 μg/mL的表面蛋白可减少内化菌量达100倍;100和200 μg/mL表面蛋白能够显著地降低单核增生李斯特菌引起的促炎因子IL-6和 TNF-α 表达(P<0.05),以及毒力因子(inlA,plc A,plc B,act A和prf A)(P<0.05)的转录水平;表面蛋白能浓度依赖性地增加跨膜电阻(P<0.05),减少FITC-Dextran含量(P<0.05);减少下室中单核增生李斯特菌载量(P<0.05)以及提升相关紧密连接蛋白(ZO-1,Claudin-1和Occludin)(P<0.05)转录水平。上述结果提示屎肠球菌WEFA23的表面蛋白可通过修复单核增生李斯特菌引发的肠屏障损伤,降低细胞炎性介质和致病菌自身毒力因子水平,减少内化Caco-2细胞的致病菌载量。第三章探究了屎肠球菌WEFA23表面蛋白对单核增生李斯特菌感染小鼠的干预作用。结果显示,屎肠球菌表面蛋白能降低小鼠死亡率15%,显著增加小鼠体重(P<0.05),减少移位小鼠肝脏、结肠和盲肠致病菌载量(P<0.05);表面蛋白有效缓解了致病菌感染引起的宿主肠屏障破坏:增加小鼠结肠组织杯状细胞数量,恢复肠道组织结构完整性,增加小鼠结肠中紧密连接蛋白(Claudin-1,Occludin和ZO-1)表达量;有效缓解致病菌感染引起宿主肠道免疫紊乱:减少肝脏和脾脏重量,肝脏组织中的炎性浸润,肝脏组织中CD4+和CD8+T细胞数量,修复脾脏结构(白髓数量和体积正常,边缘区和动脉周围淋巴鞘边界清晰,脾索肥大),显著降低小鼠血清中促炎因子IL-1β含量(P<0.05)。上述结果提示屎肠球菌WEFA23表面蛋白可通过改善肠屏障的结构,调节宿主免疫,减少定植小鼠组织的致病菌载量,起到恢复小鼠体重,减少其死亡率的效果。第四章LC-MS/MS测序分析出屎肠球菌表面蛋白主要成分之一为鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ornithine carbamoyltransferase,OTC),根据 NCBI 屎肠球菌WEFA23全基因组序列(NZ_CP021885.1),扩增获取OTC同源臂,以pK18mobsacB-Em为骨架,构建OTC基因敲除打靶载体,电转导入屎肠球菌WEFA23感受态细胞,通过同源交换构建了表面蛋白基因敲除株,为后续深入探究分子机制提供生物材料。第五章对屎肠球菌WEFA23表面蛋白拮抗单核增生李斯特菌内化定植及免疫调节作用机制进行了总结与展望。综上所述,屎肠球菌WEFA23表面蛋白具有缓解单核增生李斯特菌感染造成的肠道屏障受损及免疫功能异常作用,其可拮抗致病菌黏附肠上皮细胞,降低致病菌感染,减少了致病菌定植量,从而减少小鼠死亡率,恢复其体重。本文结果可为阐明益生菌和致病菌的互作机制提供思路,为屎肠球菌WEFA23作为益生菌候选菌株提供科学依据。