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谷胱甘肽是一种重要的非蛋白巯基物质,在食品、化妆品和医药等领域得到了广泛的应用。本课题从经过基因工程法改造的重组菌出发,对参与体外合成GSH的谷胱甘肽双功能合成酶(GshF)和偶联ATP再生相关的多聚磷酸激酶(PPK)的表达方法进行了优化,并研究了杂蛋白表达较多的粗酶液的分离方法和分离特性。最后针对研究过程中包涵体现象较严重的多聚磷酸激酶进行了模拟结构分析,并对一类更有优势的PPK酶进行了定向进化研究,显著提高了酶的活力。具体的研究内容如下：(1)为了提高表达量,本课题首先对重组质粒的表达菌种进行优化,利用了BL21、Rosetta、OrigamB三种E.coli表达菌对比诱导表达,发现Rosetta菌的效果最好。针对PPK酶的包涵体现象,通过重新构建不同载体的重组质粒pETDuet-ppk,获得的酶用于体外合成GSH的产量提高了1.718倍。同时利用分子伴侣与目的酶共表达以促进目的酶的可溶性表达,重组质粒pETDuet-ppk同分子伴侣共表达后效果明显,获得的PPK酶用于体外合成GSH的产量提高至1.481倍,PPK酶酶活提高至1.820倍。(2)GshF酶和PPK酶的粗酶液的整体纯度较低,需要对粗酶液进行分离纯化研究。本课题实验确定了GshF酶和PPK的最适硫酸铵盐析饱和度为40%。盐析沉淀中的盐成分对酶活产生的抑制现象可以通过联合30KD聚醚砜膜的超滤处理完成有效的脱盐和浓缩。冷丙酮对GshF粗酶液可纯化倍数为1.445,收率为87.64%；冷丙酮和盐析共同处理时纯化倍数可达到1.637,收率为88.99%。(3)PPK酶表达中的包涵体现象限制了酶表达量和酶活,不仅影响了酶法体外合成GSH的整体产量,也不利于PPK酶分离纯化的研究。本课题通过结构模拟分析的方法对比了不同家族的PPK酶,研究发现Class Ⅱ PPK(PPK2)酶比实验中采用的Class Ⅰ PPK(PPK1)酶在ATP再生中更具优势。在此基础上对PPK2酶进一步定向进化,建立了高通量筛选方法及优化易错PCR突变率,使用易错PCR改造的突变株最高可提高酶活1.771倍,比活提高1.665倍。