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梨(Pyrus spp.)是重要的园艺作物,培育高品质梨果实是梨育种工作的重要目标之一。糖分含量是果实品质的一个重要指标,是消费者选择偏好的重要驱动因素之一。然而,对于梨果实中糖分积累机理的研究还不够深入。‘南果梨’(Pyrus ussuriensis cv.Nanguo[NG])抗寒性强,风味色泽俱佳,是特色梨产区的重要栽培品种。本研究以‘南果梨’及其高糖芽变(Bud sport of NG[BNG])果实为试材,通过转录组测序,挖掘到了在‘南果梨’高糖芽变果实中高表达的蔗糖转运蛋白PuSWEET15及转录因子PuWRKY31基因。通过研究PuWRKY31在‘南果梨’及其高糖芽变果实中表达量的变化及其如何调控PuSWEET15的转录,发现PuWRKY31在‘南果梨’高糖芽变中的高表达与其高乙酰化水平有关,且PuWRKY31转录因子可以直接与PuSWEET15的启动子结合并上调其表达来促进‘南果梨’高糖芽变果实中的蔗糖积累。主要研究结果如下:1.‘南果梨’高糖芽变在果实发育过程中积累更多蔗糖。通过测定‘南果梨’及其高糖芽变果实不同发育时期的可溶性固形物和糖分含量,发现在采收于2014年的样品中,‘南果梨’高糖芽变果实中的可溶性固形物含量和蔗糖含量均高于‘南果梨’果实,在采收于2018年的样品中,也得到了相同的结果。说明‘南果梨’高糖芽变的高糖含量是由高蔗糖含量的积累导致的。2.具有转运蔗糖功能的PuSWEET15在‘南果梨’高糖芽变果实中的表达量显著高于‘南果梨’果实。利用‘南果梨’及其高糖芽变盛花后134 d(采收于2014年)果实进行转录组测序,筛选到了与拟南芥中转运蔗糖的AtSWEET15蛋白氨基酸序列最为相似的PuSWEET15基因。利用qRT-PCR检测,发现在采收于2014年的样品中,‘南果梨’高糖芽变果实中PuSWEET15基因的表达量显著高于‘南果梨’果实,且基因表达趋势与蔗糖含量变化趋势一致,在采收于2018年的样品中,也得到了相同的结果。为了研究PuSWEET15蛋白的功能,本研究通过在缺陷型酵母SUSY7/ura(Saccharomyces cerevisiae)菌株中异源过表达PuSWEET15基因,发现过表达的菌株在以蔗糖为唯一碳源的尿嘧啶缺陷型SD选择培养基上生长状态优于对照组。为了进一步研究PuSWEET15蛋白的功能,在烟草中瞬时过表达PuSWEET15基因,结果表明,过表达植株中的蔗糖含量显著高于对照组。以上体外试验结果表明PuSWEET15蛋白具有转运蔗糖的功能,为了研究PuSWEET15蛋白在梨果实体内的功能,本研究在‘南果梨’果实中进行了PuSWEET15基因的瞬时过表达并在‘南果梨’高糖芽变果实中进行了PuSWEET15基因的瞬时沉默,发现过表达基因的‘南果梨’果实中的蔗糖含量显著高于对照组,沉默基因的‘南果梨’高糖芽变果实中的蔗糖含量显著低于对照组。上述试验结果表明PuSWEET15蛋白具有转运蔗糖的功能,其在果实中的蔗糖转运过程中起着十分重要的作用3.PuWRKY31转录因子上调PuSWEET15的表达。PuSWEET15基因是导致‘南果梨’高糖芽变积累高蔗糖的关键基因,为了研究其在‘南果梨’及其高糖芽变果实中的差异表达,在两个品种中对该基因的编码区及启动子(1177 bp)序列进行了克隆,没有发现序列差异。由于启动子的甲基化及组蛋白的乙酰化水平会导致基因的表达差异,本研究检测了两个品种中PuSWEET15基因启动子的甲基化及乙酰化水平,均未发现差异。由于转录因子是调控下游基因表达的重要因素,通过对PuSWEET15基因启动子上顺式作用元件的分析发现了WRKY、DOF(DNA-binding one finger)及MYB等转录因子的结合域,结合转录组测序结果,找到了在‘南果梨’高糖芽变果实中高表达的PuWRKY31基因。通过在‘南果梨’果实中过表达PuWRKY31基因(PuWRKY31-OE),发现与对照果实相比,PuWRKY31-OE果实中PuSWEET15基因的表达量显著升高,且蔗糖含量显著增加。通过EMSA及ChIP-PCR来验证PuWRKY31与PuSWEET15启动子的结合情况,并通过GUS试验研究PuWRKY31对PuSWEET15的调控作用,结果表明PuWRKY31转录因子可以直接结合到PuSWEET15基因的启动子上并上调其表达。4.组蛋白乙酰转移酶PuHLS1可以结合PuWRKY31的CDS区。为了明确PuWRKY31基因在两个品种中的表达差异,本研究比对了两个品种中PuWRKY31的编码区及启动子(1550 bp)序列,同时检测了两个品种中PuWRKY31启动子的甲基化水平,但均没有发现差异。在检测PuWRKY31启动子的组蛋白乙酰化水平时,发现‘南果梨’高糖芽变果实中PuWRKY31启动子的乙酰化水平显著高于‘南果梨’果实。为了探究‘南果梨’高糖芽变中PuWRKY31组蛋白乙酰化水平高的原因,本研究分析了转录组测序结果,找到了一个差异表达的组蛋白乙酰转移酶基因PuHLS1(HOOKLESS 1),经qRT-PCR检测,PuHLS1在‘南果梨’高糖芽变果实中的表达量显著高于‘南果梨’果实。EMSA试验结果表明,PuHLS1可以与PuWRKY31的CDS区结合,说明PuHLS1可能与PuWRKY31的组蛋白乙酰化水平有关。以上结果表明:转录因子PuWRKY31的高组蛋白乙酰化水平使其在‘南果梨’高糖芽变中高表达,进而促进蔗糖转运蛋白基因PuSWEET15的转录,导致‘南果梨’高糖芽变果实蔗糖含量升高。