适用于RNAi防控朱砂叶螨的靶基因筛选

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朱砂叶螨(Tetranychuscinnabarinus)是一种世界性害螨,能危害多种农作物,且抗性问题突出,随着人们对食品安全、农药残留等问题的关注度日益增高,亟需探索和研究新的防控方法。RNAi技术不仅作为一种基因沉默的有效工具,近年来也作为一种潜力巨大的新型有害生物防治方法而颇受关注。同时朱砂叶螨作为一种多食性害螨,其寄主适应机制涉及大量基因表达变化,因此可从中筛选出起关键作用的基因作为RNAi防治靶标。  本研究将朱砂叶螨从豇豆(VignasinensisEndl)转移至茄子(SolanummelongenaL.),利用RNA-Seq技术检测寄主转移后不同时间段螨体内基因表达的变化,筛选出两条差异表达基因。同时还选取了对朱砂叶螨生命活动(如:蜕皮、消化、代谢、信号转运等)有重要影响的七条基因,一共九条作为候选靶标基因。通过叶碟饲喂法进行RNAi实验,以羽化率、百头重、死亡率等参数及相关表型评价其干扰效果;在此基础上利用植物瞬时表达技术将候选靶标基因的dsRNA片段导入茄子植株中,模拟朱砂叶螨与含靶标基因的dsRNA茄子植株互作,检测并评价防控效果。综合分析筛选出适用于防控茄上朱砂叶螨的最佳靶标基因。主要研究结果如下:  1.通过RNA-Seq分析朱砂叶螨转移取食茄子后(2d、50d)的差异基因,注释了七条在2d和50d均表达上调的基因,选择谷氨酸膜内蛋白酶1基因CaaXprenylproteinaseRce1(CPPR)、极长链脂肪酸伸长酶1基因elongationofverylongchainfattyacidsprotein1(FAP)这两条作为后续研究的靶标基因。  2.利用文献分析,选取可能涉及朱砂叶螨重要生命活动过程的三类共七条基因也作为候选靶标基因:(1)消化代谢类:β-外被体蛋白基因coatomerproteincomplex;subunitbeta2(β-COP)、细胞色素P450还原酶基因cytochromeP450reductase(CPR);(2)生长发育类:类固醇11-β-脱氢酶2基因corticosteroid11-beta-dehydrogenaseisozyme2/shord(Sro)、几丁质合成酶1基因chitinsynthase-1(CS)、蜕皮激素受体基因ecdysonereceptor(ER);(3)保守蛋白:肌动蛋白基因beta-centractinβ(Actin)、延伸因子基因elongationfactor(EF)。  3.对候选靶基因序列进行克隆和信息学分析,并在此基础之上进行RNAi。检测靶标基因沉默效率发现,Actin基因沉默效率极低,ER、CS基因沉默效率在40-50%,其余基因沉默效率均大于60%;干扰CPPR、FAP、β-COP、Sro基因后对朱砂叶螨的生命活动有显著性影响,其中干扰雌成螨β-COP基因36h后,实验组死亡率相较对照组有显著提高,干扰108h后死亡率可达57.4%,死亡形式表现为四对足蜷缩在体侧;干扰若螨Sro基因96h后,死亡率达28.8%,表现为在蜕皮过程中无法蜕皮或在静伏期死亡。  4.利用茄子幼苗瞬时表达靶标基因进行防效验证实验,各处理对植株本身的生长和发育没有显著影响;β-COP、Sro、FAP基因组15d后的叶面受害指数显著低于空白对照组,可抑制朱砂叶螨对茄子植株的危害。  综上,使用两种干扰方法对候选靶基因进行筛选和验证的结论趋向一致:即β-COP、Sro、FAP基因可作为RNAi防控茄子上朱砂叶螨的靶基因。
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