【摘 要】
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种间杂交雄性不育是自然界普遍现象,是物种形成生殖隔离的重要方式。犏牛作为牦牛（Bos grunniens）和普通牛（Bos taurus）的种间杂交后代,表现为公犏牛不育,而母犏牛可育,是研究种间杂交雄性不育的良好动物模型。近年来利用分子生物学技术发现犏牛睾丸组织中大量基因表达紊乱。研究表明,DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA等表观遗传因素参与精子发生过程。最近,研究揭示了mi RNA主要在哺
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（项目编号:31802046）； 中央高校基本科研业务费（项目编号:XDJK2019RC001）； 重庆市自然科学基金（项目编号:cstc2018jcyjAX0524）； 中央高校基本科研业务费学生项目“piRNA 生成相关基因对犏牛雄性不育的影响研究”（项目编号:XDJK20
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种间杂交雄性不育是自然界普遍现象,是物种形成生殖隔离的重要方式。犏牛作为牦牛（Bos grunniens）和普通牛（Bos taurus）的种间杂交后代,表现为公犏牛不育,而母犏牛可育,是研究种间杂交雄性不育的良好动物模型。近年来利用分子生物学技术发现犏牛睾丸组织中大量基因表达紊乱。研究表明,DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA等表观遗传因素参与精子发生过程。最近,研究揭示了mi RNA主要在哺乳动物精原细胞的有丝分裂期和减数分裂前期调控,pi RNA主要在精母细胞减数分裂时期进行调控,表明mi RNA和pi RNA可影响哺乳动物生殖。因此,探究mi RNA、pi RNA对犏牛睾丸生精的影响可能会为犏牛雄性不育提供新的见解和思路。本课题选取F1成年雄性不育犏牛（n=8）、牦牛（n=8）和普通牛（n=8）的睾丸组织及其他组织,主要采用TUNEL细胞凋亡检测、RT-q PCR、载体构建、细胞转染、双荧光素酶报告、小RNA转录组测序（s RNA-seq）（犏牛,n=2;牦牛,n=2;普通牛n=2）等技术,针对mi RNA和pi RNA对犏牛雄性不育的影响进行探究,获得如下实验结果:（1）利用s RNA-seq技术对三种牛睾丸组织进行mi RNA分析,普通牛、牦牛、犏牛分别获得1.993、2.069、1.768Gbp的raw reads。犏牛睾丸中mi RNAs占s RNAs比例约为35%,显著多于（P＜0.05）牦牛（～9%）和普通牛（～8%）;犏牛中27个mi RNAs相比普通牛和牦牛都显著下调（|log2（foldchange）|＞1,P＜0.01）,8个mi RNAs在都显著上调;RNA-Seq和RT-q PCR显示,犏牛bta-mi R-200a、bta-mi R-449a、bta-mi R-34c、bta-mi R-15b对比牦牛、普通牛皆显著下调（P＜0.05）,bta-mi R-101、bta-mi R-145、bta-mi R-30-5p皆显著上调（P＜0.05）;犏牛下调的bta-mi R-449a、bta-mi R-34c、bta-mi R-200a分别靶向上调的NOTCH1、NANOS2、USP9X,差异mi RNA靶基因主要富集在精原干细胞向精母细胞分化过程;GO和KEGG通路富集表明靶基因主要富集在核糖体和HIF-1信号通路。（2）利用s RNA-seq技术对三种牛睾丸组织pi RNA转录组进行差异分析,普通牛、犏牛、牦牛分别获得1.967×10~7、1.768×10~7、2.036×10~7条clean reads;pi RNAs基因组来源比对分析表明,犏牛中来源于基因组DNA的29～31nt粗线期pi RNAs表达减少,来源于转座子的26～27nt前粗线期pi RNAs表达增加;犏牛粗线期pi RNA cluster 2680、5129和5758表达量低于牦牛和普通牛,犏牛前粗线期pi RNA cluster 3649、6797和3647表达量高于牦牛和普通牛;pi RNA通路相关基因和转座因子的RT-q PCR表明,大部分pi RNA通路相关基因（PIWIL1、DDX4、MAEL、PLD6、TDRD1、TDRD9、RNF17、FKBP6、AGO2和MOV10L1）在犏牛睾丸中表达显著下调（P＜0.05;P＜0.01;P＜0.001）。犏牛睾丸中LINE1、LINE-RET、SINE-CORE m RNA的表达量显著低于牦牛、普通牛（P＜0.05）。（3）睾丸石蜡切片HE染色显示犏牛精子发生受阻,与精子发生正常的牦牛和普通牛比较,其曲细精管中不存在圆形精子和长形精子细胞;TUNEL细胞凋亡分析显示,犏牛、普通牛、牦牛睾丸细胞凋亡率分别为1.05%、0.24%、0.40%;凋亡相关基因的RNA-seq、RT-q PCR显示,犏牛对比牦牛、普通牛只有CASP9差异显著（P＜0.05）,犏牛大部分细胞凋亡相关基因差异不显著。（4）RT-q PCR技术显示,UTX、USP9X在犏牛睾丸中显著上调（P＜0.05）;s RNA-seq和RT-q PCR显示,犏牛显著下调的bta-mi R-200a的靶基因USP9X显著上调（P＜0.05）;双荧光素酶报告系统靶向验证显示,突变试验组WT-200a的萤火虫相对荧光值（Ratio）对比其余5组均差异显著（P＜0.05;P＜0.01;P＜0.001）,表明bta-mi R-200a可以有效结合USP9X的3’UTR端并使其降解,表明mi RNA对犏牛精子发生的表观修饰作用。综上所述,本研究对犏牛、牦牛和普通牛睾丸组织的mi RNA及靶基因差异分析表明,犏牛表达下调的mi RNAs与其精子发生相关靶基因表达上调相关;USP9X是bta-mi R-200a的靶基因;pi RNA差异分析表明,犏牛中来源于基因组DNA的粗线期pi RNAs减少与pi RNA通路相关基因表达下调相关,来源于转座子的前粗线期pi RNAs增加与转座因子表达下调相关。这些研究结果为犏牛雄性不育的表观遗传研究提供了理论和科学依据。
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