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第一部分T细胞功能相关的候选mi RNAs以及细胞因子在异基因造血干细胞移植患者中的差异性表达的分析目的探讨异基因造血干细胞移植术(allo-HSCT)后伴有及不伴有急性移植物抗宿主病(a GVHD)的患者外周血CD4+T细胞及血浆中8个候选mi RNAs的差异性表达情况及相关细胞因子表达情况分析。方法8个待选mi RNAs差异性表达分析:选择健康志愿者作为对照,并参照a GVHD评分标准,选择异基因造血干细胞移植术后100天内无a GVHD以及发生Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ度a GVHD的患者,通过荧光定量PCR技术检测不同实验组外周血CD4+T淋巴细胞和血浆中8个待选的mi RNAs的差异性表达情况。通过细胞因子检测试剂盒分析不同实验组细胞因子差异性表达。结果1.与对照组相比,在a GVHD组有4个mi RNAs出现了差异性表达,其中,mi R-150和mi R-181a明显下调(P<0.05),mi R-155和mi R-92b明显上调(P<0.05);而mi R-17,mi R-92a,mi R-146a以及mi R-146b的表达差异无统计学意义(P>0.05);患者血浆中mi RNAs的表达水平和上述淋巴细胞中的表达情况一致的。此外,通过ELISA检测不同实验组血浆中细胞因子的表达差异,在a GVHD患者中,IL-2、IFN-γ、TNF和IL-17A的分泌水平明显上调(P<0.05),其中IL-2,IFN-γ,TNF与a GVHD的程度呈正相关。IL-10和IL-4的分泌水平明显下调(P<0.05),其中IL-10与a GVHD轻重程度呈负相关性;而IL-6的分泌水平未见明显变化;在未发生a GVHD患者组中,IL-2、IFN-γ和TNF分泌水平明显下调(P<0.05),而IL-10、IL-4、IL-17A和IL-6的分泌水平未见明显变化(P>0.05),a GVHD发生之前各细胞因子水平均未见明显变化(P>0.05)。在发生a GVHD患者中,mi R-181a和mi R-150的表达水平明显下调,并且和a GVHD的严重程度呈负相关(P<0.05),mi R-155的表达水平明显上调,并且和a GVHD的严重程度呈正相关(P<0.05),mi R-92b的表达水平则明显上调(P<0.05)。此外,在GVHD发生≥4前,mi R-181a,mi R-150,mi R-155以及mi R-92b的表达水平已经开始明显改变。结论mi R-181a,mi R-150,mi R-155和mi R-92b在a GVHD发生中存在差异性表达;Th1免疫应答是导致a GVHD发生的主要效应机制,mi RNAs和细胞因子的表达水平与a GVHD的发生程度均有相关性;差异性表达的mi RNAs可以用于预测a GVHD的发生。第二部分mi R-181a对CD4+T淋巴细胞功能影响、作用机制的体外研究及靶基因的筛选、鉴定目的对候选mi RNAs进行的靶基因预测、筛选和鉴定;探讨mi RNA对CD4+T淋巴细胞功能影响及其可能的作用机制。方法通过生物信息学分析,筛选mi RNA潜在的靶基因,通过q RT-PCR、Western blot及荧光素酶报告基因实验确定候选mi RNAs的靶基因。通过三质粒系统进行慢病毒包装,构建表达mi RNA前体的慢病毒(LV-mi RNA)及空载体(LV-Ctrl),感染正常人初始CD4+T细胞,实时定量PCR技术检测mi RNA在CD4+T细胞中的相对表达量;通过流式细胞术对IFN-γ、IL-17A、IL-4以及Foxp3进行检测,以评价各亚群细胞的比例;通过CCK-8及Annexin V/7-AAD检测细胞的增殖及凋亡情况,ELISA检测细胞培养上清中细胞因子分泌的情况;此外,通过制备过表达mi R-181a的慢病毒载体,以不同的病毒滴度感染一定数量的CD4+T细胞,然后评价IFN-γ的表达水平。结果通过生物信息学分析筛选mi R-181a的潜在的19个靶基因,其中包括IFN-γ在内的5个靶基因是明显下调的;荧光素酶报告基因实验证实,感染mi R-181a后,IFN-γ-WT的荧光活性明显减低而IFN-γ-mu无明显改变。进一步通过CD4+T细胞过表达mi R-181a后IFN-γ的基因m RNA水平未见明显变化,而蛋白水平较空白对照组及空载体对照组明显下降,且其水平与mi R-181a的水平呈负相关(P<0.05);成功构建了表达mi R-181a前体的慢病毒载体并感染CD4+T细胞,mi R-181a表达量升高约4倍(P<0.05);通过流式对T细胞亚群分析提示,相较于对照组,LV-181a组Th1细胞比例明显减少,Th2及Treg细胞比例增高,Th17无明显变化;CCK-8检测显示LV-mi R-181a组细胞增殖活性减低(P<0.05),Annexin V/7-AAD检测显示LV-mi R-181a组凋亡细胞比例增加(P<0.05)。ELISA显示LV-mi R-181a组细胞培养上清中IFN-γ及IL-17A分泌减少(P<0.05)、IL-4分泌显著增加(P<0.05);此外,随着mi R-181a浓度的递增,IFN-γ的m RNA水平无差异性变化,但是通过对IFN-γ的蛋白水平检测,发现其表达水平递减,与mi R-181a浓度呈负相关。结论Mi R-181a通过靶向IFN-γ调控CD4+T淋巴细胞功能;mi R-181a对CD4+T淋巴细胞的功能调控具有浓度依赖性。第三部分mi R-181b在小鼠异基因造血干细胞移植模型中,对急性移植物抗宿主病发生的影响目的探讨mi RNA在小鼠体内对急性移植物抗宿主病发生的作用。方法通过q RT-PCR、Western blot及荧光素酶报告基因实验确定在小鼠体内相应mi RNAs对靶基因的靶向作用。获取转染LV-mi R-181b的供鼠脾脏淋巴细胞和骨髓细胞,分别以尾静脉注射LV-mi R-181b、LV-Ctrl和PRIM 1640培养基的C57BL/6小鼠为供鼠,q RT-PCR检测供鼠脾脏及骨髓细胞中mi R-181b的表达;建立异基因造血干细胞移植模型,以BALB/c小鼠为受鼠,分别取各种供鼠脾脏及骨髓单个核细胞尾静脉注射入受鼠,行异基因造血干细胞移植,观察移植后各组小鼠生活状态、体重变化并监测造血重建情况,参照a GVHD临床评分标准对各组小鼠a GVHD发生情况进行综合评分,对小鼠肝脏、小肠等脏器进行病理学检测,参照a GVHD病理学评分标准进行评分,通过ELISA技术及流式细胞术检测不同实验组小鼠血浆中细胞因子及脾细胞Th细胞亚群的变化。结果通过Gene Bank等数据库比对,我们发现mi R-181a在人、鼠中同源,其成熟序列相同,q RT-PCR结果显示,与尾静脉注射LV-Ctrl和PRIM 1640培养基供鼠相比,注射LV-mi R-181a的供鼠脾脏单个核细胞mi R-181a的表达量升高约2.48倍(P<0.05),骨髓单个核细胞mi R-181a的表达无明显变化。移植后,供鼠尾静脉注射mi R-181a(即LV-mi R-181a移植组)的受鼠体内IFN-γm RNA的蛋白及基因水平均未见明显改变,通过进一步的荧光素酶报告基因实验证实,在小鼠体内mi R-181a对IFN-γ不产生作用。进一步的生物信息学分析及荧光素酶报告基因实验证实在小鼠内mi R-181b和mi R-181d而非mi R-181a和mi R-181c靶向IFN-γ的3’UTR。在小鼠体内过表达mi R-181b后,通过实时定量PCR和Western blot技术分别检测IFN-γ的表达水平,结果提示IFN-γ的蛋白水平明显下降(P<0.05)而基因水平未见明显改变(P>0.05),证实了在小鼠体内,是mi R-181b靶向小鼠IFN-γ基因;在小鼠移植模型中,细胞因子检测结果提示,相比较于TBI组,GVHD组的Th1细胞的数量明显增高(P<0.05),而IFN-γ,IL-2和TNF的水平明显增加(P<0.05),相同的时间点mi R-181b变化提前于a GVHD的发生;鼠内过表达mi R-181b可以减少Th1细胞应答并阻止a GVHD发生:在小鼠体内过表达mi R-181b后,实时定量PCR检测其表达升高约4倍,并且mi R-181b过表达组a GVHD的严重程度较对照组明显减轻(P<0.05),而总的生存率较高(P<0.05);同样,mi R-181b实验组a GVHD靶器官如肝脏、肠道及皮肤损伤程度减轻,病理评分下降(P<0.05)。结论在小鼠体内,mi R-181b靶向IFN-γ基因;mi R-181b可以作为小鼠a GVHD发生的预测指标;mi R-181b可以有效控制Th1细胞应答,从而减轻小鼠a GVHD。