目的：SEMA3B是一种分泌性蛋白,蛋白有前体和分泌型两种,分子量分别为83kd、51kd,基因位于3p21.3的LUCA区,在肝细胞癌中存在很高的甲基化(～83%)它的主要作用除了对神经细胞轴突发育发挥作用外,还能诱导乳腺癌、肺癌的凋亡。新近研究发现证实,SEMA3B在前列腺癌、卵巢癌等多种肿瘤中有不同程度的表达下调,最近有研究表明SEMA3B基因在肝细胞癌中存在较高的失活率,但在蛋白水平的表达及其临床意义尚未见报道。本实验通过检测SEMA3B蛋白在肝细胞癌中表达情况,分析其与肝细胞癌患者临床指标的关系,探讨SEMA3B能否作为评价患者预后的重要指标。资料与方法：1.临床标本与病理资料收集56例2008年7月至2009年6月山东大学齐鲁医院普外科手术切除的肝细胞癌患者癌组织和癌旁组织(癌旁组织距癌切线≥1cm),同时收集14例正常肝组织作为对照。所有标本均经病理检查,手术切缘均未查见转移。所有肝癌患者术前均未行射频消融、介入等特殊治疗,其中男47例,女9例。年龄32-73岁,中位年龄56岁。所有标本离体后立即取材,一部分放置于液氮中保存,另一部分放于中性福尔马林后进行石腊包埋切片。2.免疫组织化学SEMA3B多克隆抗体(ABCAM,英国)1：200稀释。步骤按照通用二抗试剂盒(GeneTex,美国)说明书进行。鼠抗人CD34单克隆抗体(SANTA,美国)1：200稀释。实验步骤同SEMA3B。Western Blotting证实高表达SEMA3B的肝癌标本为阳性对照,CD34以正常肝组织血管作为阳性对照；PBS代替一抗作为阴性对照。SEMA3B以细胞质内出现棕黄色颗粒为标准。采用半定量积分法,每张切片随机选择5个视野,高倍镜下计数500个细胞(1)染色强度评分标准：不着色0分,黄色1分,棕黄色2分.黄褐色3分；(2)阳性细胞所占比例评分标准：阳性细胞数≤25%者0分,-50%者1分,-75%者2分,>75%者3分；(3)按上述两者评分之和为：0-3分为(-),4分及以上为(+)。MVD计数方法：在100×光镜下观察下,选取5个血管密度最高的区域,然后在200×光镜(0.708mm2)下计数。5个区域的平均值作为MVD值。将每个染成棕色的细胞和细胞簇、有或无完整管腔结构定义为一个血管。结果判断均由2名高年资病理科医生核准。3. Western blotting用研磨棒将200mg组织研碎,加入0.6ml细胞裂解液(北京碧云天公司)30min,然后在12000rpm4℃离心10min,取上清液。根据BCA蛋白浓度定量试剂盒(北京碧云天公司)测量蛋白浓度。蛋白100℃变性5min。取50-tg总蛋白,以10%聚丙酰胺凝胶电泳后,用湿转法将蛋白转移至PVDF膜,TBST配置5%脱脂奶粉封闭1小时。将PVDF膜置入1：5000稀释的兔抗人SEMA3B多克隆抗体(ABCAM,英国)中,4。C孵育过夜。第二天TBST洗膜10min*3次后放入1：2000稀释的羊抗兔二抗(北京碧云天公司)室温1.5小时。用TBST沈膜10min*3次。ECL发光试剂盒(MILLIPORE,美国)进行显影曝光。4.统计学处理计数数据的组间比较采用刀检验,采用Kaplan-Meier生存分析方法绘制生存曲线,生存曲线差异比较采用Log Rank法,使用SPSS18.0统计软件进行统计分析,P<0.05表示有统计学差异。结果：1.SEMA3B蛋白的表达情况：SEMA3B定位于肝癌癌细胞、癌旁细胞和正常肝细胞的胞浆。免疫组化检测了56例肝细胞癌、癌旁肝组织及14例正常肝组织中SEMA3B蛋白的表达,结果显示：肝细胞癌组织SEMA3B的阳性率为42.9%,低于正常肝组织及癌旁组织(阳性率分别为78.6%、85.7%),P值均小于0.05,差异显著。Western blotting显示肝癌组织的表达量低于癌旁肝组织,得到与免疫组化相同的结果。2. MVD的表达：在本实验中,200×光镜视野下(0.708mm2)所得到的MVD的中位数值为92,将MVD值>92定义为高表达,≤92的为低表达。其中高表达组为112±7.5,低表达组为85.1±4.4。SEMA3B阴性组中的MVD值明显高于阳性组,差异具有统计学意义。SEMA3B与MVD呈负相关关系。3. SEMA3B蛋白与HCC临床病理特征之间的关系：根据肝细胞癌的临床病理特征(性别、年龄、乙肝、AFP、肝硬化程度、肿瘤细胞分化情况、大小、有无完整包膜、肿瘤结节数目、CLIP评分以及TNM分期进行分组,研究SEMA3B蛋白在HCC中表达与HCC临床病理特征的关系。SEMA3B阳性组的肿瘤结节数多于阴性组,阳性组的肿瘤大于阴性组,阳性组的肿瘤包膜完整数多于阴性组,阳性组的CLIP评分低于阴性组,P值分别为0.045、0.034、0.009、0.013,差异具有统计学意义。4. SEMA3B蛋白与预后的关系：本组56例肝癌患者均获随访,其中SEMA3B蛋白阳性组24例,阴性组32例。阳性组的复发转移率明显低于阴性组(P=0.009,图6)；阳性组的生存率显著高于阴性组。结论：SEMA3B蛋白在肝细胞癌癌组织表达水平降低,与肿瘤发展、血管形成及预后密切相关,提示SEMA3B可作为评价预后的指标,同时可能是肝细胞癌患者新的抗血管治疗靶点。