目的:随着研究的不断深入,细胞生物学家和结构学家让我们对穿孔素如何与细胞膜相互作用以及CTLs(Cytotoxic T Lymphocytes)如何杀死靶细胞有了更多的认识。并且随着研究的进行,科学家们发现穿孔素在噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(Hemophagocytic Lymphohistiocytosis,HLH)、白血病、淋巴瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病等疾病的发病机制中发挥重要作用。在这些疾病中,穿孔素的调节失衡或者变异会造成疾病的发生,因此有研究人员提出研究抑制穿孔素的靶向药物,进而减少免疫抑制剂的使用,治疗患者的同时提高患者生活质量。目前,市面上商品化的穿孔素蛋白大多数通过酵母系统表达并纯化,不具备生物学活性。有活性的穿孔素蛋白一直是制约相关研究广泛开展的重要限制因素。本研究旨在优化穿孔素蛋白的制备方法,在此基础之上,以一种简易、经济的方式获取具有生物学活性的人穿孔素蛋白,为后续穿孔素相关疾病的研究提供条件。方法:(1)为了纯化出的大量具备活性的穿孔素蛋白,我们使用昆虫系统来进行表达和纯化,将人穿孔素的基因序列携带标签与载体进行同源重组,再转染入昆虫细胞sf9中;(2)为了以简便的方式纯化蛋白,我们使用人工制作简易的镍柱装置进行蛋白质亲和层析,并使用超滤管对纯化产物进行浓缩;(3)为了确定纯化产物是否为人穿孔素蛋白,我们采用考马斯亮蓝染色分析纯化过程中每一步的产物,并采用银染法将纯化蛋白进行定量,使用Western blot技术检测纯化蛋白的穿孔素蛋白表达量以及是否携带Flag标签;(4)为了测量纯化的人穿孔素蛋白的生物学活性,我们将纯化的人穿孔素蛋白与人乳腺癌细胞MCF-7细胞进行共孵育后采用PI染色,使用流式细胞术分析其打孔活性;结果:(1)我们将带标签的穿孔素基因序列进行扩增后与载体成功进行同源重组,转染入昆虫细胞sf9并成功获得杆状病毒;(2)从考马斯亮蓝染色结果看,我们通过简化的纯化方式纯化出了较高纯度的蛋白;(3)根据Western blot检测结果和银染结果,我们纯化蛋白的纯度还有提升空间,从一定量的昆虫细胞中,纯化出来的人穿孔素蛋白量很大,携带Flag标签,证明纯化蛋白为我们构建并纯化的携带His标签和Flag的穿孔素蛋白;(4)纯化的穿孔素蛋白在Ca2+离子的存在下,具有在人乳腺癌细胞MCF-7细胞膜上打孔的生物学活性。结论:具有高水平表达重组蛋白的潜能是昆虫系统的一个主要优点,另一个优点是具有真核蛋白的加工能力,包括对蛋白质进行磷酸化或糖基化等的修饰能力,昆虫细胞生长速度快,蛋白的产量比真核系统大。我们只要将构建好的质粒转染入昆虫细胞后获取杆状病毒并保存,下一次的蛋白表达纯化只需将杆状病毒取出感染昆虫细胞就可完成一次重复,较真核系统和酵母系统更为便捷。本研究探索出一种方便快捷的方法,在sf9昆虫细胞内表达并纯化出具有生物学活性的人穿孔素蛋白。