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脓毒症（Sepsis）是宿主对感染反应失调而导致危及生命的器官功能障碍,严重时可发展成为脓毒症休克,甚至多器官功能衰竭。肝脏因为血运丰富,具有代谢、解毒和免疫等功能,使其成为在脓毒症中极易被炎症因子损伤的靶器官之一。肝功能障碍将影响脓毒症患者的预后。脓毒症时炎性细胞如巨噬细胞等被过度激活,使炎症因子如白介素-6（Interleukin-6,IL-6）、白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）等大量释放入血,可介导肝损伤。最近研究表明,在脓毒症肝损伤中除了有细胞凋亡、细胞焦亡的参与,还存在着肝细胞铁死亡。铁死亡是一种依赖于铁的脂质过氧化和活性氧堆积导致的细胞死亡方式。铁代谢或活性氧代谢异常都会促进铁死亡的发生。已有研究表明,脓毒症小鼠肝脏中脂质过氧化水平和铁含量升高,发生了铁死亡。且脓毒症患者存在铁代谢异常,有铁调素（Hepcidin）升高,血清铁降低。铁调素主要由肝细胞合成和分泌,可内化降解肝细胞膜的铁输出蛋白1（Ferroportin1,FPN1）,使铁无法转运出肝细胞,导致肝细胞铁超载。在脓毒症等炎症疾病中,IL-6使铁调素编码基因（HAMP）转录增加。那么IL-6是否可以通过调节HAMP转录,引起铁调素分泌和FPN1蛋白含量变化,导致铁超载,进而影响肝脏铁死亡,目前尚未见报道。核因子 E2 相关因子 2（Nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2）是一个转录因子,作用于靶基因的抗氧化反应元件（Antioxidant response elements,AREs）,具有抗氧化作用。同时可以作用于炎症因子如IL-6、IL-1β的启动子区域,抑制其转录,发挥抗炎作用。因此,本课题拟进一步探究脓毒症时如果上调Nrf2的活性,可否通过抑制IL-6/HAMP-铁调素通路,增加FPN1蛋白含量,从而促进肝细胞的铁转运,减轻铁超载和铁死亡,从而减轻肝损伤。目的:探讨Nrf2对脓毒症肝脏铁死亡的影响及其可能分子机制。方法:采用C57/BL6小鼠盲肠结扎穿孔术（Cecal ligation and puncture,CLP）构建脓毒症肝损伤动物模型;脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）刺激RAW264.7细胞模拟脓毒症时巨噬细胞的激活状态;再取RAW264.7细胞培养液上清培养原代小鼠肝细胞,模拟体内脓毒症激活的巨噬细胞分泌炎症因子影响肝细胞。动物随机分成四组,假手术组（Sham）、CLP组、CLP+Nrf2激动剂（萝卜硫素,Sulforaphane,SFN）组、CLP+去铁胺（Deferoxamine,DFO）组。运用免疫印迹、实时荧光定量PCR、酶联免疫吸附、苏木素-伊红染色等方法,在CLP术后12 h检测肝组织IL-6 mRNA、铁调素HAMP mRNA、铁输出蛋白1（FPN1）、非血红素铁以及血清IL-6和铁调素等铁代谢指标,检测铁死亡相关指标PTGS2 mRNA、NADPH、MDA及其肝功能指标ALT、AST的变化,并观察肝组织形态学改变;在细胞水平上,对巨噬细胞给予LPS和有或无Nrf2激动剂SFN刺激后,收集巨噬细胞培养液上清处理原代肝细胞,运用细胞免疫荧光、实时荧光定量PCR、免疫印迹、活细胞染色等方法,检测巨噬细胞的Nrf2移位、IL-6转录和表达,检测原代肝细胞的铁调素HAMP转录和表达、FPN1含量变化以及铁死亡指标活性氧和二价铁离子水平的变化。结果:1.CLP脓毒症小鼠出现了肝损伤、肝组织铁超载与铁死亡与Sham组相比,CLP组小鼠肝组织中肝索结构排列紊乱,肝窦狭窄,炎症细胞浸润;小鼠血清中ALT、AST显著增高。这些结果提示CLP导致肝组织形态和功能损伤。与Sham组比较,CLP小鼠肝组织中非血红素铁含量明显增加,NADPH、MDA和PTGS2mRNA水平也显著升高;与CLP组相比,铁死亡抑制剂铁离子螯合剂DFO处理组（CLP+DFO组）肝组织中非血红素铁含量明显减少,NADPH、MDA和PTGS2 mRNA水平显著降低,血清中ALT和AST减少;肝组织电镜结果显示,与Sham组相比,CLP组肝细胞内线粒体皱缩,线粒体嵴减少或消失,CLP+DFO组线粒体形态无显著改变;这些结果说明脓毒症小鼠存在肝组织铁超载和肝细胞铁死亡。2.IL-6/HAMP-铁调素/FPN1通路参与脓毒症时肝脏铁超载在动物水平,与Sham组比较,CLP组小鼠肝组织中IL-6、HAMP mRNA含量显著增加;小鼠血清中IL-6、铁调素含量显著升高;肝组织中FPN1蛋白含量降低。在细胞水平,qPCR和ELISA结果显示,在巨噬细胞RAW264.7中给予LPS刺激后,其IL-6 mRNA及其蛋白表达显著升高;与对照组原代肝细胞（Control,Ctrl组）或用巨噬细胞对照组培养上清处理的原代肝细胞（Control conditioned medium,Ctrl-CM组）相比,LPS刺激的巨噬细胞培养上清处理的原代肝细胞组（LPS conditioned medium,LPS-CM）中 HAMP mRNA 和铁调素含量显著升高,FPN1蛋白含量降低,Fe2+水平升高;与LPS-CM组相比,LPS-CM与去铁胺共处理的原代细胞（LPS-CM+DFO组）胞内Fe2+水平降低。这些结果提示脓毒症小鼠肝组织出现的铁超载,可能与巨噬细胞/肝细胞中的IL-6/HAMP-铁调素通路激活,肝细胞FPN1含量减少,导致肝细胞铁转运障碍有关。3.Nrf2调节IL-6/HAMP-铁调素/FPN1通路改善肝铁超载和铁死亡在细胞水平,与对照组相比,LPS组RAW264.7细胞胞浆和胞核的Nrf2蛋白含量均明显降低,给予Nrf2激动剂SFN后,胞浆、特别是胞核中的Nrf2蛋白含量显著增高;与LPS组相比,LPS+SFN组RAW264.7细胞的IL-6 mRNA及其蛋白表达水平显著降低。与LPS-CM组相比,LPS+SFN刺激的巨噬细胞培养上清处理的原代肝细胞组（LPS+SFN conditioned medium,LPS+SFN-CM）中HAMP mRNA和铁调素含量显著降低,FPN1蛋白含量升高,铁死亡指标活性氧和二价铁离子水平显著降低。在动物水平,与CLP组相比,CLP+SFN组（CLP术后给予SFN）肝组织中Nrf2蛋白表达水平增加,IL-6、HAMP mRNA量显著降低;小鼠血清中IL-6、铁调素含量显著降低;肝组织中FPN1蛋白含量升高;非血红素铁含量显著降低,NADPH、MDA和PTGS2mRNA水平显著降低,肝细胞内线粒体形态结构正常。这些结果提示上调Nrf2可改善脓毒症小鼠肝脏铁死亡,其机制与其抑制巨噬细胞/肝细胞中的IL-6/HAMP-铁调素通路,增加肝细胞FPN1含量,减轻铁超载有关。结论:1.脓毒症导致小鼠肝脏发生了炎症细胞浸润和肝功能障碍,并出现了肝组织铁超载和肝细胞铁死亡;2.IL-6/HAMP-铁调素/FPN1通路参与了脓毒症导致的肝铁超载;3.脓毒症时巨噬细胞Nrf2表达减少和活性降低,激活Nrf2可抑制IL-6/HAMP-铁调素通路,维持FPN1水平,改善肝细胞铁超载及铁死亡。