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背景髁突软骨骨关节炎是颞下颌关节紊乱综合征最重要的类型之一,在动物体中由颞下颌区域的磨损和退行性改变引起,以关节软骨损伤为主要特征,表现为软骨细胞的凋亡,软骨细胞外基质的破坏和软骨下骨的吸收。研究发现白细胞介素-1β可以诱导颞下颌骨关节炎的形成。一氧化碳在体外有抑制细胞凋亡,减轻炎症反应的作用。研究证明一氧化碳释放分子-3可以在一定条件下可控性缓慢释放CO,表现出与CO相似的调节机能。但一氧化碳释放分子-3是否能够抑制白细胞介素-1β诱导的颞下颌骨关节炎的炎性反应尚不清楚。目的(1)以大鼠髁突软骨细胞作为体外实验模型,研究一氧化碳释放分子-3对白细胞介素-1β刺激下的髁突软骨细胞的调节作用和可能的作用机制。(2)以白细胞介素-1β诱导的大鼠颞下颌骨关节炎的大鼠作为动物模型,探究一氧化碳释放分子-3对大鼠颞下颌骨关节炎的调控作用。方法(1)大鼠髁突软骨细胞的分离、培养、冻存和鉴定:采用二次酶消法分离培养大鼠髁突软骨细胞,传代,冻存,并用甲苯胺蓝染色法鉴定是否为软骨细胞。(2)一氧化碳释放分子-3(carbon monoxide releasing molecule-3,CORM-3)对白细胞介素-1β(IL-1β)诱导下髁突软骨细胞HO-1通路的影响:通过HO-1 Si-RNA转染使髁突软骨细胞的HO-1基因沉默,18 h后采用RT-qPCR检测转染后HO-1的mRNA的表达变化。实验分组:空白组:软骨细胞在空白培养基中培养。炎症组:软骨细胞在含有IL-1β(10 ng/ml)的培养基中培养。iCORM-3组:软骨细胞在含有IL-1β(10 ng/ml)与iCORM-3(提前24小时配置的CORM-3溶液,200 μM)的培养基中培养。CORM-3组:软骨细胞在含有IL-1β(10 ng/ml)与CORM-3的培养基中培养。沉默组:HO-1沉默后的软骨细胞在含有IL-1β(10 ng/ml)与CORM-3(现用现配,200μM)的培养基中培养。24 h 后用 RT-qPCR 检测各组细胞中 Col-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA的表达。实验至少要重复三次,结果用Graphpad Prism进行统计学分析。如实验只有两个组,采用T检验进行比较;如实验有两个以上组别,采用单因素方差分析法,用Turkey检验进行组间的两两比较;认为P<0.05差异具有统计学意义。(3)颞下颌骨关节炎动物模型的建立:大鼠双侧颞下颌关节腔注射完全弗式佐剂(CFA,50 μg)和白细胞介素-1β(IL-1β,10ng/ml)诱导大鼠颞下颌骨关节炎模型,通过HE染色中髁突软骨细胞的形态、排列,软骨下骨细胞及,表面纤维层的形态学变化等检测是否建模成功。(4)CORM-3对大鼠骨关节炎中HO-1、Col-2和MMP因子的影响:实验分组:空白组:双侧颞下颌关节腔内注射50μ1生理盐水;炎症组:双侧颞下颌关节注射50 μ1含IL-1β(10 ng/ml)的CFA试剂;iCORM-3组:双侧颞下颌关节腔注射50 μ1含IL-1β(10 ng/ml)的CFA试剂,24 h后腹腔注射预处理过的iCORM-3(提前24 h配置溶液以使CORM-3失活),连续7天;CORM-3组:双侧颞下颌关节腔注射50μ1含IL-1β(10 ng/ml)的CFA试剂,24 h后腹腔注射CORM-3连续7天。本步骤所用CORM-3和iCORM-3的浓度为10 mg/kg/day。第八天取材切片,免疫组化测定HO-1、Co12、MMP-3、MMP-9、MMP-13蛋白的表达。结果(1)将大鼠髁突软骨通过二次酶消法提取的细胞传代培养后呈“铺路石样”,状态良好,进行甲苯胺蓝染色鉴定为软骨细胞。(2)CORM-3显著抑制IL-1β诱导的大鼠髁突软骨细胞MMP-3、MMP-9、MMP-13的表达,显著增强Col-2、HO-1的表达。CORM-3对HO-1基因沉默后的炎性大鼠髁突软骨细胞中的Col-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13的调控作用较沉默前显著减弱,证明CORM-3对炎性大鼠髁突软骨细胞的抗炎作用可能是通过HO-1通路发挥作用的。(3)大鼠双侧颞下颌关节注射50 μ1含IL--1β(10 ng/ml)的CFA试剂后,可见大鼠进食减少,眼周有血泪,颞下颌关节区出现肿胀。一周后HE染色显示颞下颌关节盘与髁突软骨之间的间隙变小,髁突软骨层变薄,且关节盘有部分缺损,关节腔内充满炎性分泌物,有纤维蛋白渗出。关节盘附近有血管和脂肪滴生成。结果提示颞下颌关节炎动物模型建模成功。(4)免疫组织学染色显示COMR-3升高颞下颌关节炎大鼠的髁突软骨中HO-1和Col-2的表达,降低MMP-3、MMP-9、MMP-13的表达。结果提示CORM-3在体内对颞下颌关节炎有抑制作用,且这种作用可能与HO-1有关。结论CORM-3对IL-1β诱导的大鼠髁突软骨细胞的炎性反应及颞下颌骨关节炎有抑制作用,表现为其抑制MMP-3、MMP-9、MMP-13的表达,增强Col-2的表达。CORM-3的调节作用可能是通过HO-1通路进行的,表现为HO-1表达沉默后,CORM-3对IL-1β诱导的大鼠髁突软骨细胞的炎性反应调节作用减弱。该研究结果为颞下颌骨关节炎的治疗提供了新的思路和实验依据。