论文部分内容阅读
目的:黄曲霉毒素(Aflatoxins,AF)是黄曲霉菌(Aspergillus flavus)等真菌产生的具有致癌作用真菌毒素,包括AFB1、B2、G1、G2和M1等。黄曲霉毒素G1(Aflatoxin G1,AFG1)在我国胃癌、食管癌高发区居民饮食中的检出率很高,是当地粮食主要的污染真菌毒素。本研究室前期实验发现采用含有AFG1的饮食可以诱导实验动物肺癌。同时发现长期灌胃AFG1诱发的NIH小鼠肺腺癌组织来源于Ⅱ型肺泡上皮细胞(Alveolar typeⅡcells,AT-Ⅱ)。进一步整体和细胞水平上研究发现AFG1对大鼠肺AT-Ⅱ具有致损伤生物毒性作用,提示AT-Ⅱ可能是AFG。作用肺组织诱发腺癌发生的靶细胞。认识和探讨其致AT-Ⅱ生物毒性效应和机制可以为揭示AFG1与肺腺癌发生的可能关系提供科学依据。
研究发现许多致癌性真菌毒素早期毒性作用是导致细胞凋亡或增殖抑制。包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮及烟曲霉毒素B1等多种真菌毒素都是通过激活靶细胞上MAPK通路的一条或多条,而诱导细胞凋亡,发挥其致损伤生物毒性作用。丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinase,MAPK)级联是细胞内重要的信号转导系统之一,参与细胞的各种生理及病理活动,包括细胞增殖、分化和凋亡。MAPKs家族最主要的成员为ERK(细胞外信号调节激酶)通路,JNK/SAPK.(c-Jun氨基末端激酶/应激活化蛋白激酶)通路和p38 MAPK通路。所以探讨AFG1通过激活MAPK通路而对AT-Ⅱ细胞凋亡的影响,对进一步认识AFG1致AT-Ⅱ细胞毒性作用机制具有重要意义。
我们研究室前期采用具备人Ⅱ型肺泡上皮细胞生物学特点A549细胞作为研究对象探讨AFG1致AT-Ⅱ细胞毒性作用的可能机制,发现AFG1激活MAPK家族之一JNK信号转导通路参与其毒性作用。但是AFGl是否通过激活ERK和p38通路致AT-Ⅱ细胞凋亡而介导其生物毒性作用还不清楚。
在前期实验基础上,本研究采用A549细胞作为研究对象,探讨不同剂量AFG1对AT-Ⅱ细胞凋亡以及ERK和p38 MAPK信号通路激活的影响;此外通过给予阻断剂,进一步研究信号通路在AFG1诱导AT-Ⅱ细胞凋亡中的调控作用。旨在明确AFG1通过激活MAPK通路而诱导AT-Ⅱ细胞凋亡,以期揭示AFG1致AT-Ⅱ细胞毒性作用可能分子机制。
方法:
1.细胞培养与AFG1处理
A549细胞培养于含10％胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的DMEM培养基中,37℃、5%CO2培养,细胞贴壁生长。
选择对数生长期的细胞(传代后24 h)随机分为溶剂对照组和实验组。实验组给予溶解DMSO的AFG1,使其终浓度分别为0.5、2、4和10 mg/L,溶剂对照组给予终浓度为1%的DMSO,继续培养24h收集细胞进行相关指标检测。
2. p38和ERK阻断剂预处理
对数生长期A549细胞,分别给予10μM SB203580(p38的阻断剂)或者10μM PD98059(ERK的阻断剂)预处理30 min。实验分为4组,即溶剂对照组、阻断剂组、2 mg/LAFG1处理组和阻断剂+2 mg/LAFG1处理组。细胞处理24 h后收集细胞检测相关指标。
3. p38特异性siRNA转染
实验组给予100 pmol p38特异性和Negative control(NC)siRNA转染细胞,再加入2 mg/L AFG1继续培养24 h。对照给予100 pmo1 NC siRNA转染细胞后,加入DMSO培养24 h。
4.流式细胞术检测细胞凋亡(FCM)
分别收集各组细胞,PBS洗涤,离心收集细胞,采用Annexin V和PI细胞染色,FCM检测细胞凋亡。
5.蛋白免疫印迹(Western blot)
细胞给予处理24 h后,提取细胞总蛋白,用蛋白免疫印迹方法,检测ERK/磷酸化型ERK、p38/磷酸化型p38以及凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达情况。
6.统计
采用SPSS13.0软件进行相关分析与单因素方差分析(analysis ofvariance,ANOVA),数据用-x±s表示,检验以P＜0.05为差异有显著性意义。
结果:
1. AFG1对AT-Ⅱ细胞凋亡的影响
FCM结果显示,AFG10.5、2、4、10 mg/L处理细胞24 h后,细胞凋亡率分别为7.82±0.47%,11.00±1.02%,15.30±3.14%和20.04±0.45%,明显高于对照组6.33±0.65%,并且存在明显的剂量依赖关系(P＜0.05,r=0.90,P＜0.001)。实验结果说明AFGl诱导AT-II细胞凋亡。
2. AFG1对AT-Ⅱ细胞凋亡调控蛋白Bax和Bcl-2表达的影响
进一步研究AFG1对细胞凋亡的影响,我们检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达。给予AFG1作用AT-Ⅱ24 h后,Western blot结果显示AFGl明显升高Bax表达,降低Bcl-2表达(P＜0.05)。结果表明AFG1通过调控细胞凋亡蛋白诱导AT-Ⅱ细胞凋亡。
3. AFGl对AT-Ⅱ细胞ERK和p38信号通路激活的影响
Westem blot结果显示,AFG10.5、2、4、10 mg/L处理24 h后,p38和ERK磷酸化水平明显高于溶剂对照组(P＜0.05)。同时,各AFG1处理组细胞内非磷酸化p38和ERK蛋白水平均未发生明显变化(P＞0.05)。
为进一步证明AFG1处理激活AT-Ⅱ细胞内的p38和ERK信号通路。我们给予ERK和p38特异性阻断剂(PD98059和SB203580)预处理细胞30 min,检测2 mg/L AFG1对AT-Ⅱ细胞p38和ERK信号通路激活的影响。结果显示ERK阻断剂预处理组ERK磷酸化水平和p38阻断剂预处理组p38磷酸化水平明显低于AFG1处理组(P＜0.05),说明阻断剂拮抗了AFG1对AT-Ⅱ细胞ERK和p38信号通路的激活作用。
结果表明,AFG1处理可以激活AT-Ⅱ细胞内的p38和ERK信号通路。4 ERK和p38特异性阻断剂预处理对AFG1诱导AT-Ⅱ细胞凋亡的影响FCM结果显示,p38阻断剂SB203580预处理+2 mg/L AFG1组细胞凋亡率为9.05±1.56%,明显低于AFG1组12.76±2.39%,但是高于对照组6.67±0.53%(P＜0.05),提示SB203580可以部分抑制AFG1诱导AT-Ⅱ细胞凋亡作用。SB203580预处理+2 mg/L AVG1组Bax表达低于AFG1组,Bcl-2的表达高于AFG1组(P＜0.05),提示阻断p38通路抑制AFG1对凋亡调控蛋白的影响。结果显示AFG1激活p38通路,通过调控凋亡相关基因Bax和Bcl-1的表达,部分介导其诱导的AT-Ⅱ细胞凋亡。
而进一步研究发现,与2 mg/L AFG1组比较,给予PD98059预处理+2 mg/L AFG1组细胞凋亡率没有明显改变。Western blot结果显示PD98059预处理对于AFG1诱导上调Bax和下调Bcl-2表达没有影响。结果提示PD98059对AFGl诱导AT-Ⅱ细胞凋亡没有抑制作用,AFG1激活ERK信号通路,不参与AT-Ⅱ细胞凋亡的调控。
5. p38 siRNA干扰对AFG1诱导AT-Ⅱ细胞凋亡的影响
FCM研究结果显示,AFG1作用p38 siRNA转染后细胞其细胞凋亡率为7.62±0.73%,明显低于AFG1作用于NC siRNA转染后细胞11.24±2.30%,但是高于对照组6.35±2.34%(P＜0.05),表明p38 siRNA可部分逆转AFG1诱导AT-Ⅱ细胞凋亡。同时发现p38 siRNA阻断p38通路后,AFG1诱导的上调Bax和下调Bcl-2的作用明显受到抑制。实验结果进一步确证AFG1激活p38通路部分介导其诱导的AT-Ⅱ细胞凋亡。
结论:
1. AFGl诱导Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡。
2. AFG1上调凋亡相关蛋白Bax的表达,下调Bcl-2的表达。
3. AFG1激活AT-Ⅱ细胞p38和ERK信号转导通路。
4. AFG1激活p38通路,通过调控凋亡相关基因Bax和Bcl-2的表达,部分介导其诱导的AT-Ⅱ细胞凋亡作用。
5. AFG1激活ERK信号通路,但不参与AT-Ⅱ细胞凋亡的调控