论文部分内容阅读
水稻齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus,RRSV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)水稻病毒属(Oryzavirus)的典型成员,引起水稻齿叶矮缩病,是东南亚、东亚、和南亚一些国家局部发生的病害。RRSV基因组包括10条双链RNA片段(S1-S10),本文报道了福建农林大学植物病毒研究所分离纯化并经室内保存20多年的RRSV福建沙县分离株(RRSV-F)的基因组S8和S10片段的编码区克隆、原核表达、Pns10融合蛋白抗血清的制备和P8蛋白的系统进化分析结果。 通过有机试剂抽提,CF—11纤维素柱层析,从感病水稻叶片中获取该病毒的全基因组,根据RRSV泰国分离株(RRSV-T)S10开放阅读框(ORF)核苷酸序列(nt142-1035)和S8开放阅读框核苷酸序列(nt23-1810)分别设计引物,通过RT—PCR方法扩增出特异性目的条带。PCR扩增产物经回收、连接、转化DH5α大肠杆菌克隆至pMD18-T载体上,经蓝白斑和氨苄青霉素抗性筛选和双酶切和PCR法鉴定,分别获得了重组质粒pMD18-T S10和pMD18-T S8,并进行了序列测定和分析。RRSV-F和RRSV-T分离物S10基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.66%和99.83%,而RRSV-F和RRSV-P分离物S8基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.72%和99.87%,RRSV-F和RRSV-T分离物S8基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.61%和99.75%,并在氨基酸水平上构建了呼肠孤病毒科部分侵染植物的呼肠孤病毒和褐飞虱病毒(NLRV)外层衣壳蛋白系统进化树,结果表明RRSV与斐济病毒属亲缘关系较近,与植物呼肠孤病毒属亲缘关系较远。 本文利用Directional TOPO克隆技术将平整末端单向克隆的S10和S8基因分别转入pET100/D-TOPO载体,构建了原核表达载体,并在BL21star(DE3)E.coli中得到了高效表达,分别获得了约35kD的Pns10融合蛋白和70kD的P8融合蛋白。将获得的Pns10融合蛋白免疫大耳白兔制备了抗血清,间接ELISA法测定抗血清效价为1:7680,效价高,Western blot鉴定表明抗血清特异性强。表达产物及多克隆抗体的获得为下阶段深入研究提供了实验材料。