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目的：核糖体合成调节蛋白1(human regulator of ribosome synthesis 1, RRS1)是参与核糖体生物合成的重要蛋白，其主要功能是招募5SRNP的各组分(RPL11、RPL5及5sRNA)进入初期核糖体，参与Pre-rRNA的加工并调控核糖体的生物合成，与人类疾病的发生、发展密切相关。近年来，RRS1在肿瘤中的作用日益受到关注。乳腺癌是目前全球女性发病率最高的恶性肿瘤之一，其死亡率占到女性恶性肿瘤死亡总人数的20%，位居我国女性癌症相关死亡病因的第2位，严重威胁着女性的生命健康。大量的研究认为乳腺癌是一种基因异质性疾病，乳腺癌基因的改变，导致乳腺癌患者具有不同的临床结局。而这些基因的改变大多被认定为乳腺癌发生、发展的关键因素。近年来，乳腺癌的总体诊疗水平取得了较大进展，特别是分子靶向治疗，比如针对Her-2(+)的曲妥珠单抗，在临床治疗中取得了较大的成功，显著改善了患者的生存和预后。因此，寻找与乳腺癌增殖、侵袭相关的新的功能基因，深入研究其功能调控机制，是对该疾病实现精准医疗及预警的重要基础。本研究旨在明确RRS1在乳腺癌中的表达情况、验证RRS1在乳腺癌中的功能，并进一步探讨RRS1在乳腺癌中发挥功能的机制。
方法：采用免疫组织化学法(Immunohistochemistry, IHC)检测242例乳腺癌组织中RRS1的表达情况，分析RRS1的表达与患者临床病理特征之间的关系、分析患者无病生存期及总体生存期与RRS1表达的关系；留取24对新鲜乳腺癌组织和癌旁非癌组织，采用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR, RT-qPCR)检测组织中RRS1mRNA表达水平及RRS1基因拷贝数变异(Copy number variations, CNVs )，并分析RRS1mRNA的表达与CNVs的相关性。
体外培养一系列乳腺癌细胞株ZR-75-30、MCF-7、MDA-MB-231、BT-549、T-47D、MDA-MB-468，采用RT-qPCR检测细胞中RRS1mRNA表达丰度；选择RRS1表达丰度高的3种乳腺癌细胞系及永生化的人乳腺上皮细胞HMEC继续培养，并检测各细胞系中RRS1mRNA及蛋白的相对表达水平。构建带有绿色荧光蛋白GFP的含抗性基因的慢病毒载体，对上述细胞进行转染，在荧光显微镜下观察细胞转染情况，并加入嘌呤霉素筛选出稳定转染阴性对照病毒和RRS1基因ShRNA病毒的细胞继续培养，用蛋白印迹法(Western blot, WB)检测慢病毒转染前后RRS1的表达量，确认目的基因敲减效率。采用MTT法、BrdU法检测细胞的增殖活力；流式细胞术(Flow cytometry, FCM)检测细胞周期的分布情况；AnnexinV-APC检测细胞凋亡情况、Caspase3/7活性测定检测细胞凋亡水平的变化；Transwell实验和侵袭小室法检测RRS1基因沉默后不同乳腺癌细胞的转移、侵袭能力；培养稳定转染阴性对照病毒和RRS1基因ShRNA病毒的MDA-MB-231细胞，并建立裸鼠皮下移植瘤模型，观察肿瘤发生、发展的情况，从体内验证RRS1基因促进乳腺癌增殖的功能。
培养稳定转染阴性对照病毒和RRS1基因ShRNA病毒的MCF-7细胞，采用WB检测RRS1敲减后乳腺癌细胞中p53及p21蛋白的表达情况；蔗糖浓度梯度离心法分离核糖体和游离核糖体部分，WB法分别检测核糖体与游离核糖体中RPL11的表达情况；利用免疫沉淀实验(Co-Immunoprecipitation, COIP)分析RRS1敲减后，p53与鼠双微粒体基因2(murine double minute 2, MDM2)，MDM2与RPL11、RPL5的关系。
结果：RRS1主要定位在乳腺癌上皮细胞的核仁中，242例乳腺癌组织中RRS1蛋白阳性表达147例，阴性表达95例，其阳性表达率60.7%(147/242)。其异常表达与患者淋巴结转移状态有关(X2=5.463,P＜0.05)；与患者雌激素受体(Estrogen receptor, ER)状态有关(X2=22.753，P＜0.01)，孕激素受体(Progestrone receptor, PR)状态有关(X2=20.907，P＜0.01)、Her-2(Human epidermal growth factor receptor-2, Her-2)状态有关(X2=12.535，P＜0.01)。相反，RRS1异常表达与患者年龄、TNM分期等无关；Kaplan-Meier生存分析结果表明RRS1高表达的患者具有相对较长的无病生存期(Disease free survival, DFS)，但总生存期(Overall survival, OS)在两者之间没有明显差异；24例乳腺癌组织中RRS1mRNA表达量明显高于配对癌旁非癌组织。同时，相比较配对的癌旁非癌组织，癌组织中RRS1的CNVs明显增加。相关性分析表明RRS1的CNVs与RRS1mRNA表达水平呈明显的正相关(R2=0.438,P＜0.05)。
为了进一步验证RRS1在乳腺癌中的高表达，我们检测了一系列乳腺癌细胞系中RRS1的表达情况，RT-qPCR结果显示，乳腺癌细胞株ZR-75-30、MCF-7、MDA-MB-231、BT-549、T-47D、MDA-MB-468中均有不同程度的RRS1表达，其中MCF-7、MDA-MB-231、BT-549细胞中RRS1mRNA表达丰度较高，同时又代表了不同的乳腺癌分子类型，故而选作RRS1功能研究的工具细胞。培养乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、BT-549及HMEC细胞，进一步检测RRS1mRNA及蛋白的相对表达水平。结果显示三株乳腺癌细胞中RRS1基因mRNA及蛋白的相对表达水平均明显高于HMEC细胞(P＜0.01)。使用含有目的基因RNA干扰序列的慢病毒感染乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、BT-549，同时设置阴性对照组(加入阴性对照病毒的MCF-7、MDA-MB-231、BT-549细胞)，RT-qPCR及WB法检测工具细胞中目的基因敲减后mRNA及蛋白水平的表达量，进而判断靶点的干扰效果。结果显示，RRS1-shRNA转入细胞后，RRS1mRNA及蛋白的表达水平明显低于阴性对照组，敲减效率达到80%以上。
MTT法检测细胞增殖结果显示，病毒感染第三天开始，目的基因敲减组(shRRS1)细胞的增殖活力较阴性对照组(shCtrl)细胞明显减低；BrdU法检测细胞增殖结果显示shRRS1与shCtrl细胞在酶标仪对波长450nm的光的吸收率随时间变化差距开始明显增加，OD450在这里反映了具有活力的细胞的数量。第3天时，相比shCtrl组，shRRS1组细胞增殖明显减缓(P＜0.05)。进一步采用FCM法检测细胞周期，结果显示敲减RRS1明显将MCF-7、MDA-MB-231细胞阻滞在G1期(P＜0.05)，将BT-549细胞阻滞在细胞周期G2期(P＜0.01)。为了进一步检测RRS1敲减后细胞凋亡情况，采用AnnexinV-APC检测细胞的早期凋亡率，结果显示shRRS1组三种细胞均出现明显的凋亡。其中MCF-7细胞在RRS1敲减后，早期凋亡细胞达到31.7%，相比较shCtrl组细胞凋亡率明显增加(P＜0.05)。Caspase3/7在细胞凋亡过程中起到重要的作用。在一些内部或外部凋亡信号作用下，Caspase3/7活性被激活，比如可以通过影响核酸内切酶活性，使其剪切核小体间得DNA，进一步促进细胞凋亡。因此可以通过检测Caspase3/7活性，进而检测细胞凋亡情况。ShRNA慢病毒感染MCF-7、MDA-MB-231、BT-549细胞，7天后，shRRS1组与shCtrl组的Caspase3/7活性对比，shRRS1组Caspase3/7活性明显高于shCtrl组细胞，凋亡明显增多(P＜0.05)。
细胞迁移是肿瘤转移的一个重要指标，应用Transwell可研究肿瘤细胞的运动能力。实验结果显示，各实验组在Transwell小室内孵育16h后的转移细胞数对比：相比shCtrl组，shRRS1组MDA-MB-231细胞迁移能力明显降低，shRRS1组迁移的细胞数为164±2.27，shCtrl组迁移细胞数为84±2.80，具有明显统计学差异(P＜0.01)；相比shCtrl组，shRRS1组BT-549细胞迁移能力明显降低，shRRS1组迁移的细胞数为66±3.21，shCtrl组迁移细胞数为40±4.51，具有明显统计学差异(P＜0.05)。从细胞外基质入侵是肿瘤转移的一个重要步骤，肿瘤细胞穿过重建基质膜的能力与它的体内侵袭转移能力表现出较好的相关性。结果显示，各实验组在侵袭小室内孵育20h后的转移细胞数对比，相比shCtrl组，shRRS1组MDA-MB-231细胞侵袭能力明显降低，shRRS1组迁移的细胞数为200±21.49，shCtrl组迁移细胞数为66±5.60，具有明显统计学差异(P＜0.01)；相比shCtrl组，shRRS1组BT-549细胞迁移能力明显降低，shRRS1组迁移的细胞数为27±4.16，shCtrl组迁移细胞数为16±2.46，具有明显统计学差异(P＜0.05)。
裸鼠移植瘤瘤体生长曲线表明，相比shCtrl组，shRRS1组瘤体生长明显减缓，在肿瘤生长的第28天测量瘤体体积较小，差异有统计学意义(255.29vs.394.62mm3;P＜0.05)；瘤体解剖后，将组织匀浆提取总RNA及蛋白，RT-qPCR及WB结果显示shRRS1组瘤体组织RRS1蛋白及mRNA表达明显低于对照组组织。
p53参与了大量的核仁应激反应，p53蛋白在肿瘤的增殖、凋亡中具有重要作用。我们收集稳定敲低RRS1的MCF-7细胞，提取总蛋白，用WB方法检测p53及p21的蛋白表达。结果发现，shRRS1组p53蛋白水平显著升高，同时位于p53下游，与细胞周期G1/S期过渡相关的p21蛋白表达量也升高(P＜0.05)，进而诱导细胞凋亡及周期阻滞。5SRNP是核糖体组装过程中的中介复合物，包括RPL11、RPL5以及5SrRNA。我们收集稳定敲减RRS1的MCF-7细胞，提取细胞总蛋白，行WB检测，结果显示RRS1敲减后RPL11的总蛋白量并没有显著变化，但是通过蔗糖浓度梯度离心法分离核糖体与游离核糖体后，发现RRS1敲减后RPL11在核糖体中的表达量减少，相反在游离核糖体中的蛋白表达量增多。MDM2是p53下游特定的泛素连接酶E3，可以泛素化降解p53的表达，p53反过来能激活MDM2。免疫沉淀结果表明RRS1敲减后，MDM2与RPL11及RPL5之间的相互作用增强，相反MDM2与p53之间的相互作用减弱。从而说明RRS1敲减后，RPL11、RPL5不能正常进入核糖体，使得RPL11、RPL5在核质中滞留，在核质中RPL11、RPL5与MDM2结合，从而减弱了MDM2对p53的抑制作用，p53被激活。
结论：RRS1在乳腺癌组织中过表达，其异常表达与患者淋巴结转移及ER、PR状态有关；RRS1表达程度与患者的生存期有关；RRS1在乳腺癌细胞中的表达量明显高于正常乳腺细胞，敲减RRS1能明显诱导乳腺癌细胞凋亡及增殖抑制、并且能明显抑制乳腺癌细胞裸鼠移植瘤的生长；敲减RRS1能明显抑制细胞侵袭和迁移能力；敲减RRS1可以诱导p53及p21蛋白明显聚集，进而导致细胞凋亡及细胞周期阻滞；另外，RRS1沉默后，核糖体中RPL11表达明显减低，游离核糖体中表达量增加。敲减RRS1能导致MDM2与RPL11、RPL5之间的相互作用增强，MDM2与p53之间的相互作用减弱，导致p53激活。因此，敲减RRS1通过调控RPL11在核糖体中表达量进而调节MDM2/53的相互作用，最终调控细胞凋亡及细胞周期进程。
方法：采用免疫组织化学法(Immunohistochemistry, IHC)检测242例乳腺癌组织中RRS1的表达情况，分析RRS1的表达与患者临床病理特征之间的关系、分析患者无病生存期及总体生存期与RRS1表达的关系；留取24对新鲜乳腺癌组织和癌旁非癌组织，采用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR, RT-qPCR)检测组织中RRS1mRNA表达水平及RRS1基因拷贝数变异(Copy number variations, CNVs )，并分析RRS1mRNA的表达与CNVs的相关性。
体外培养一系列乳腺癌细胞株ZR-75-30、MCF-7、MDA-MB-231、BT-549、T-47D、MDA-MB-468，采用RT-qPCR检测细胞中RRS1mRNA表达丰度；选择RRS1表达丰度高的3种乳腺癌细胞系及永生化的人乳腺上皮细胞HMEC继续培养，并检测各细胞系中RRS1mRNA及蛋白的相对表达水平。构建带有绿色荧光蛋白GFP的含抗性基因的慢病毒载体，对上述细胞进行转染，在荧光显微镜下观察细胞转染情况，并加入嘌呤霉素筛选出稳定转染阴性对照病毒和RRS1基因ShRNA病毒的细胞继续培养，用蛋白印迹法(Western blot, WB)检测慢病毒转染前后RRS1的表达量，确认目的基因敲减效率。采用MTT法、BrdU法检测细胞的增殖活力；流式细胞术(Flow cytometry, FCM)检测细胞周期的分布情况；AnnexinV-APC检测细胞凋亡情况、Caspase3/7活性测定检测细胞凋亡水平的变化；Transwell实验和侵袭小室法检测RRS1基因沉默后不同乳腺癌细胞的转移、侵袭能力；培养稳定转染阴性对照病毒和RRS1基因ShRNA病毒的MDA-MB-231细胞，并建立裸鼠皮下移植瘤模型，观察肿瘤发生、发展的情况，从体内验证RRS1基因促进乳腺癌增殖的功能。
培养稳定转染阴性对照病毒和RRS1基因ShRNA病毒的MCF-7细胞，采用WB检测RRS1敲减后乳腺癌细胞中p53及p21蛋白的表达情况；蔗糖浓度梯度离心法分离核糖体和游离核糖体部分，WB法分别检测核糖体与游离核糖体中RPL11的表达情况；利用免疫沉淀实验(Co-Immunoprecipitation, COIP)分析RRS1敲减后，p53与鼠双微粒体基因2(murine double minute 2, MDM2)，MDM2与RPL11、RPL5的关系。
结果：RRS1主要定位在乳腺癌上皮细胞的核仁中，242例乳腺癌组织中RRS1蛋白阳性表达147例，阴性表达95例，其阳性表达率60.7%(147/242)。其异常表达与患者淋巴结转移状态有关(X2=5.463,P＜0.05)；与患者雌激素受体(Estrogen receptor, ER)状态有关(X2=22.753，P＜0.01)，孕激素受体(Progestrone receptor, PR)状态有关(X2=20.907，P＜0.01)、Her-2(Human epidermal growth factor receptor-2, Her-2)状态有关(X2=12.535，P＜0.01)。相反，RRS1异常表达与患者年龄、TNM分期等无关；Kaplan-Meier生存分析结果表明RRS1高表达的患者具有相对较长的无病生存期(Disease free survival, DFS)，但总生存期(Overall survival, OS)在两者之间没有明显差异；24例乳腺癌组织中RRS1mRNA表达量明显高于配对癌旁非癌组织。同时，相比较配对的癌旁非癌组织，癌组织中RRS1的CNVs明显增加。相关性分析表明RRS1的CNVs与RRS1mRNA表达水平呈明显的正相关(R2=0.438,P＜0.05)。
为了进一步验证RRS1在乳腺癌中的高表达，我们检测了一系列乳腺癌细胞系中RRS1的表达情况，RT-qPCR结果显示，乳腺癌细胞株ZR-75-30、MCF-7、MDA-MB-231、BT-549、T-47D、MDA-MB-468中均有不同程度的RRS1表达，其中MCF-7、MDA-MB-231、BT-549细胞中RRS1mRNA表达丰度较高，同时又代表了不同的乳腺癌分子类型，故而选作RRS1功能研究的工具细胞。培养乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、BT-549及HMEC细胞，进一步检测RRS1mRNA及蛋白的相对表达水平。结果显示三株乳腺癌细胞中RRS1基因mRNA及蛋白的相对表达水平均明显高于HMEC细胞(P＜0.01)。使用含有目的基因RNA干扰序列的慢病毒感染乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、BT-549，同时设置阴性对照组(加入阴性对照病毒的MCF-7、MDA-MB-231、BT-549细胞)，RT-qPCR及WB法检测工具细胞中目的基因敲减后mRNA及蛋白水平的表达量，进而判断靶点的干扰效果。结果显示，RRS1-shRNA转入细胞后，RRS1mRNA及蛋白的表达水平明显低于阴性对照组，敲减效率达到80%以上。
MTT法检测细胞增殖结果显示，病毒感染第三天开始，目的基因敲减组(shRRS1)细胞的增殖活力较阴性对照组(shCtrl)细胞明显减低；BrdU法检测细胞增殖结果显示shRRS1与shCtrl细胞在酶标仪对波长450nm的光的吸收率随时间变化差距开始明显增加，OD450在这里反映了具有活力的细胞的数量。第3天时，相比shCtrl组，shRRS1组细胞增殖明显减缓(P＜0.05)。进一步采用FCM法检测细胞周期，结果显示敲减RRS1明显将MCF-7、MDA-MB-231细胞阻滞在G1期(P＜0.05)，将BT-549细胞阻滞在细胞周期G2期(P＜0.01)。为了进一步检测RRS1敲减后细胞凋亡情况，采用AnnexinV-APC检测细胞的早期凋亡率，结果显示shRRS1组三种细胞均出现明显的凋亡。其中MCF-7细胞在RRS1敲减后，早期凋亡细胞达到31.7%，相比较shCtrl组细胞凋亡率明显增加(P＜0.05)。Caspase3/7在细胞凋亡过程中起到重要的作用。在一些内部或外部凋亡信号作用下，Caspase3/7活性被激活，比如可以通过影响核酸内切酶活性，使其剪切核小体间得DNA，进一步促进细胞凋亡。因此可以通过检测Caspase3/7活性，进而检测细胞凋亡情况。ShRNA慢病毒感染MCF-7、MDA-MB-231、BT-549细胞，7天后，shRRS1组与shCtrl组的Caspase3/7活性对比，shRRS1组Caspase3/7活性明显高于shCtrl组细胞，凋亡明显增多(P＜0.05)。
细胞迁移是肿瘤转移的一个重要指标，应用Transwell可研究肿瘤细胞的运动能力。实验结果显示，各实验组在Transwell小室内孵育16h后的转移细胞数对比：相比shCtrl组，shRRS1组MDA-MB-231细胞迁移能力明显降低，shRRS1组迁移的细胞数为164±2.27，shCtrl组迁移细胞数为84±2.80，具有明显统计学差异(P＜0.01)；相比shCtrl组，shRRS1组BT-549细胞迁移能力明显降低，shRRS1组迁移的细胞数为66±3.21，shCtrl组迁移细胞数为40±4.51，具有明显统计学差异(P＜0.05)。从细胞外基质入侵是肿瘤转移的一个重要步骤，肿瘤细胞穿过重建基质膜的能力与它的体内侵袭转移能力表现出较好的相关性。结果显示，各实验组在侵袭小室内孵育20h后的转移细胞数对比，相比shCtrl组，shRRS1组MDA-MB-231细胞侵袭能力明显降低，shRRS1组迁移的细胞数为200±21.49，shCtrl组迁移细胞数为66±5.60，具有明显统计学差异(P＜0.01)；相比shCtrl组，shRRS1组BT-549细胞迁移能力明显降低，shRRS1组迁移的细胞数为27±4.16，shCtrl组迁移细胞数为16±2.46，具有明显统计学差异(P＜0.05)。
裸鼠移植瘤瘤体生长曲线表明，相比shCtrl组，shRRS1组瘤体生长明显减缓，在肿瘤生长的第28天测量瘤体体积较小，差异有统计学意义(255.29vs.394.62mm3;P＜0.05)；瘤体解剖后，将组织匀浆提取总RNA及蛋白，RT-qPCR及WB结果显示shRRS1组瘤体组织RRS1蛋白及mRNA表达明显低于对照组组织。
p53参与了大量的核仁应激反应，p53蛋白在肿瘤的增殖、凋亡中具有重要作用。我们收集稳定敲低RRS1的MCF-7细胞，提取总蛋白，用WB方法检测p53及p21的蛋白表达。结果发现，shRRS1组p53蛋白水平显著升高，同时位于p53下游，与细胞周期G1/S期过渡相关的p21蛋白表达量也升高(P＜0.05)，进而诱导细胞凋亡及周期阻滞。5SRNP是核糖体组装过程中的中介复合物，包括RPL11、RPL5以及5SrRNA。我们收集稳定敲减RRS1的MCF-7细胞，提取细胞总蛋白，行WB检测，结果显示RRS1敲减后RPL11的总蛋白量并没有显著变化，但是通过蔗糖浓度梯度离心法分离核糖体与游离核糖体后，发现RRS1敲减后RPL11在核糖体中的表达量减少，相反在游离核糖体中的蛋白表达量增多。MDM2是p53下游特定的泛素连接酶E3，可以泛素化降解p53的表达，p53反过来能激活MDM2。免疫沉淀结果表明RRS1敲减后，MDM2与RPL11及RPL5之间的相互作用增强，相反MDM2与p53之间的相互作用减弱。从而说明RRS1敲减后，RPL11、RPL5不能正常进入核糖体，使得RPL11、RPL5在核质中滞留，在核质中RPL11、RPL5与MDM2结合，从而减弱了MDM2对p53的抑制作用，p53被激活。
结论：RRS1在乳腺癌组织中过表达，其异常表达与患者淋巴结转移及ER、PR状态有关；RRS1表达程度与患者的生存期有关；RRS1在乳腺癌细胞中的表达量明显高于正常乳腺细胞，敲减RRS1能明显诱导乳腺癌细胞凋亡及增殖抑制、并且能明显抑制乳腺癌细胞裸鼠移植瘤的生长；敲减RRS1能明显抑制细胞侵袭和迁移能力；敲减RRS1可以诱导p53及p21蛋白明显聚集，进而导致细胞凋亡及细胞周期阻滞；另外，RRS1沉默后，核糖体中RPL11表达明显减低，游离核糖体中表达量增加。敲减RRS1能导致MDM2与RPL11、RPL5之间的相互作用增强，MDM2与p53之间的相互作用减弱，导致p53激活。因此，敲减RRS1通过调控RPL11在核糖体中表达量进而调节MDM2/53的相互作用，最终调控细胞凋亡及细胞周期进程。