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前言 白血病是小儿时期最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着小儿的健康和生命。随着化疗方案的不断改进，白血病的完全缓解率和长期生存率已大大提高，但耐药的发生仍是导致化疗失败的主要原因。其中多药耐药（MDR）是一个重要的机制，而药物外排增多和滞留减少是MDR最常发生的现象。肺耐药相关蛋白（LRP）是继P-糖蛋白（P-gp）和多药耐药相关蛋白（MRP）之后又发现的药物转运蛋白，可以降低细胞内药物浓度，而导致耐药，已有研究证明，LRP与白血病的耐药有关。 LRP是从非小细胞肺癌中发现的一种非糖类蛋白质，分子量约为110KD，其cDNA序列包含一个2688个bp的开放阅读框架，编码896个氨基酸的蛋白质，LRP基因位于人类染色体16P11.2，LRP可能作为人的主要穹窿蛋白（MVP）参与细胞内的物质转运过程，最终导致细胞内药物浓度下降，而产生耐药。有研究认为，检测LRP基因的表达情况，可以预测耐药的发生，可以作为预测预后的指标之一。 本实验采用逆转录多聚酶链式反应（RT-PCR）的方法，对43例急性白血病患儿共计52份标本进行LRP基因表达水平的检测，以进一步探讨儿童白血病的耐药机制及与临床分期，化疗反应和预后的关系。 实验材料 一、研究对象 1．病例组：1999年9月－以D1年5月期间在我院儿科住院患者 43例，经 MIC分型确诊为 ALL者 28例，AML者 15例；男 29例，女14例，年龄3刁 岁，平均8岁。共采集标本52例次，分为初发组24例，完全缓解组19例，复发组9例。初发组中ALL 15例，其中 B－ALL 9例，T－ALL 6例；AML 9例。复发组中＊例为第二次复发病例＊例先后得到初发和复发两份标本，二例先后得到完全缓解和复发两份标本。初发组中5例经系统治疗达完全缓解，他们的缓解期标本均人组完全缓解组。 2．对照组J 例为ITP患儿骨髓。其中男6例，女4例，年龄4－12岁，平均8岁。 二＼实验仪器和试剂 主要试剂及实验仪器：FICOll淋巴细胞分离液购于上海试剂二厂；Trizof购于 GIBCO BRL USA；反转录试剂盒、TaqDNA聚合酶购于上海 Sangon公司；引物由上海 Sangon公司合成；DNAmarker：DL上000购于大连TAKARA公司。 实验方法 一、标本采集：于化疗前采集2毫升骨髓，并用肝素抗凝。 二、骨髓中分离单个核细胞：采用FICOll淋巴细胞分离液分离单个核细胞。 三、RT—PCR方法检测LRP基因的表达：按照TriZOI试剂盒说明提取总RNA，按逆转录试剂盒说明合成CDNA第一链后进行PCR扩增。LRP和p。MG基因的CDNA引物序列分别为： Ly上游引物：5’GTC’ITC－CTGAGCTGGTGTCG 3’ LRP下游5！物：5’C皿GCC删皿GGG0CCn 3’ p。MG上游引物：5’ACCCCCAC…AAGAM 3’ p。MG下游引物：5’ATC’trr’nAithCCTCCAltAI’n 3’ ·2· LIp扩增片段为240hP，p。MG扩增片段为120hP。 以L矾 p。MG的比值作为LRPmmA的相对表达水平。 四、统计处理：采用F分析人检验，配对t检验，秩和检验。 实验结果 一、初发组、复发组、完全缓解组和对照组W基因的表达 LRP基因表达水平：初发组N．65。0．22入复发组O．14。0．24入完全缓解组N．40 t 0．14X对照组①．41。0．11八初发组和复发组分别与对照组相比，差异均非常显著门均＜o．01人完全缓解组和对照组的差异不显著（P＞0．05人LRP基因在复发组的表达水平明显高于初发组和完全缓解组汀均＜o．01人初发组和完全缓解组之间差异也非常显著K＜0．01人 h人RP基因的表达与＊［C分型的关系 初发Au组（O．62 L O．25），初发AML组（0．7O L O．15），两者差异不显著（P＞0．05）。B－＊u组（0．＊ 土O．25），T－＊u组（O．＊。0．＊），两者差异显著（P＜0．05）。 三上RP基因表达与临床特征和临床分型的关系 初发ALL组Lgy基因表达水平在不同性别、年龄、外周血白细胞计数以及不同的临床分型（高危、低危）之间差异均不显著 ＊均＞0．05）。 卞 论 随着人们对LRP研究的深人，I．lu在多种肿瘤上过度表达而导致MDR现象也引起人们越来越多的关注。此前研究证明人RP广泛分布在正常组织和肿瘤组织中，但在正常组织中其表达水平较低，肿瘤组织中LRP表达水平较高，化疗后耐药的肿瘤组织表 ·3· 达水平更高。SchePer等研究认为LIp是一个高度保守的主穹隆 蛋白(Maior Vault Protein，MVP入与细胞的核浆转运有关，并引起 肿瘤细胞的 MDR。 我们的研究发现，对照组LRP基因表达水平较低，而在白血 病初发组和复发组中表达较高，与对照组相比，差异均显著u均 ＜0．01八复发组＊RP基因表达水平又明显高于初发组(P＜ 0．05h而完全缓解组与对照组表达水平无明显差异。提示小儿 白血病的临床耐药与LRP基因表达?