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研究背景:糖尿病及其血管病变的发病率呈逐年增高趋势。糖尿病大血管病变的主要病理改变是动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)。深入探讨糖尿病诱发或加重AS的发生机制,寻求有效的干预措施对于改善糖尿病患者生存质量具有极其重要的科学意义。硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)是具有重要的生物学效应的气体信号分子。研究表明H2S参与调控糖尿病引起的血管病变且具有抗AS的作用,但关于其在糖尿病加剧或诱发AS进程中是否有拮抗作用,目前尚无报道。越来越多的证据显示H2S可通过调控蛋白质翻译后修饰即蛋白质巯基硫化修饰(S-sulfhydration)来发挥生理功能,但该修饰是否参与糖尿病血管病变目前尚不清楚。研究目的:本研究主要在整体动物及离体细胞水平上探讨H2S对糖尿病AS的影响,阐明其发挥作用的具体机制,并明确蛋白质巯基硫化修饰在其中起到的关键调控作用。研究方法和结果:动物实验:选取8周龄、雄性LDLr-/-小鼠,连续5天腹腔注射链脲佐菌素(STZ,60 mg/kg/day),一周后通过多次血糖测定,选择空腹血糖>300 mg/dL的小鼠继续饲以高脂饲料(HFD)4周构建糖尿病AS动物模型。高脂饲料的同时,每天腹腔注射给予H2S供体GYY4137(133 pol/kg/day)或生理盐水(NS,0.1 mL/day)4周。每周监测小鼠体重并采用快速血糖仪检测空腹血糖水平变化,结果显示给予STZ及高脂饮食后(STZ+HFD),LDLr-/-、鼠体重降低、血糖升高,给予H2S供体GYY4137对小鼠体重和血糖无明显影响。给药结束后,代谢笼监测小鼠饮食、饮水及尿量,发现糖尿病AS小鼠出现明显多食、多饮、多尿症状,GYY4137干预没有明显的改善作用;试剂盒检测血浆中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)水平,结果显示,糖尿病AS小鼠血浆TC、TG、LDL-C含量显著增高,HDL-C含量降低,而GYY4137处理对血脂水平无明显影响;化学法检测血浆中H2S水平,结果发现,与对照组LDLr-/-、鼠相比,STZ合并高脂饮食造模的LDLr-/-小鼠血浆H2S水平明显下降,而GYY4137可显著增加小鼠血浆中H2S含量;主动脉根部切片油红O染色、HE染色以及主动脉大体油红O染色结果显示GYY4137可明显减轻STZ+HFD诱导的LDLr-/-小鼠主动脉内斑块面积;采用巨噬细胞特异性抗体进行免疫荧光染色,结果发现GYY4137可明显降低STZ+HFD诱导的LDLr-/-小鼠主动脉斑块上巨噬细胞的浸润。上述结果表明,H2S缓释剂GYY4137可明显延缓或减轻糖尿病AS的病变过程,在此基础上进行进一步的机制研究。DHE荧光探针检测小鼠主动脉内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量结果显示,给予GYY4137可明显抑制糖尿病AS小鼠主动脉内ROS的生成;Real time-PCR、免疫荧光法检测主动脉中Nrf2及其下游抗氧化蛋白HO-1、Trx、GCLC以及粘附分子ICAM-1、VCAM-1水水平,结果显示,给予GYY4137可增加STZ+HFD诱导的LDLr-/-小鼠主动脉内Nrf2含量及HO-1 mRNA 水平,抑制粘附分子 ICAM-1、VCAM-1 mRNA 水平,对 Trx、GCLC mRNA水平无明显作用。此外,为了进一步在整体动物实验中明确,Nrf2在H2S拮抗糖尿病AS中的确切作用,我们利用Nrf2-/-及LDLr-/-小鼠杂交繁殖Nrf2LDLr-/-双敲小鼠进行实验,发现,8周龄、雄性Nrf2-/-LDLr-/-给予对照溶剂处理4周未有斑块形成,给予STZ+HFD后斑块明显形成,而STZ+HFD合并给予GYY4137处理4周,并不能降低斑块面积。采用免疫荧光、Real time-PCR技术检测相关指标发现,在Nrf2-/-LDLr-/-双敲小鼠主动脉内,GYY4137不再降低主动脉ROS、ICAM-1、VCAM-1水平,也不能增加抗氧化蛋白HO-1 mRNA水平。细胞实验:采用高糖(HG,25 mmol/L)和氧化低密度脂蛋白(ox-LDL,50 μg/mL)共处理原代C57BL/6J小鼠腹腔巨噬细胞、人脐静脉内皮细胞(HUVECs)、EA.hy926 内皮细胞,同时给或不给 GYY4137(50、100 μmol/L)作用24 h。油红O染色结果显示H2S缓释剂GYY4137可明显抑制泡沫细胞的形成;DHE荧光染色检测显示外源性给予GYY4137(50、100 μmol/L)可明显降低由高糖和ox-LDL诱导的巨噬细胞及内皮细胞内ROS水平;免疫荧光染色及提取胞浆胞核蛋白行Western blot检测Nrf2的核转位情况,结果显示外源性给予GYY4137可明显增加巨噬细胞及内皮细胞中Nrf2的核转位;Real time-PCR、Western Blot法检测Nrf2信号通路下游抗氧化蛋白变化,发现GYY4137可明显上调巨噬细胞及内皮细胞中HO-1的mRNA及蛋白水平,并可抑制内皮细胞内粘附分子ICAM-1、VCAM-1 mRNA及蛋白水平;提取Nrf2-/-小鼠腹腔巨噬细胞后,发现Nrf2缺失后GYY4137抑制高糖和ox-LDL诱导的巨噬细胞的泡沫化、ROS的生成及上调HO-1表达的作用消失;采用siRNA沉默技术下调EA.hy926内皮细胞内Nrf2后,GYY4137降低内皮细胞ROS水平的作用减弱;应用siRNA下调内皮细胞及巨噬细胞内HO-1表达,或利用HO-1抑制剂ZnPP抑制HO-1的活性后,GYY4137不能发挥抑制高糖和ox-LDL诱导的ROS生成及巨噬细胞泡沫化的作用。此外,免疫共沉淀法观察内皮细胞上Nrf2与其调节因子Keapl之间的相互作用,结果显示在高糖和ox-LDL共处理EA.hy926内皮细胞的同时给予GYY4137(100μmol/L)可明显促进Nrf2与Keap1的解离;采用Tag-switch法检测内皮细胞巯基硫化修饰水平的变化,发现,给予GYY4137后可明显增加高糖和ox-LDL处理的内皮细胞上Keap1的巯基硫化修饰水平;在以往文献报道及结构分析的基础上,将Keap1的半胱氨酸151、273及288位点进行突变(突变为丙氨酸,以C151A、C273A、C288A表示)后进行硫巯基修饰水平的检测,结果发现在内皮细胞转入野生型(WT-Keap1)或C288A的Keap1质粒后,GYY4137作用2 h后仍可增加细胞内Keap1的巯基硫化修饰水平,而此作用在转染C151A及C273A后消失;将C151A、C273A及WTKeap1质粒转染入内皮细胞,并给予高糖和ox-LDL共处理细胞,同时给或不给GYY4137,提取内皮细胞总蛋白或胞核蛋白,免疫共沉淀和western blot结果发现,Keap1 Cys151位点突变后,GYY4137促进Nrf2和Keap1的解离及增加Nrf2的核转位作用消失;DHE染色也显示Keap1 Cysl51位点突变后,H2S不再降低由高糖和ox-LDL引起的内皮氧化应激水平。结论:H2S通过促进Keap1 Cys151巯基硫化修饰,使得Nrf2与Keap1解离,增加Nrf2的核转位,激活Nrf2信号通路,上调其下游的抗氧化蛋白HO-1,有效清除氧自由基、减轻氧化应激水平、下调细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1水平,延缓小鼠糖尿病AS的进程,改善高糖和ox-LDL诱导的巨噬细胞及内皮细胞功能,发挥抗糖尿病AS的作用,为糖尿病AS的治疗和预防提供了新的药物靶点和治疗思路,具有潜在的临床应用价值。