【摘 要】
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目的:探究C-藻蓝蛋白（C-phycocyanin,C-PC）和脱辅基藻蓝蛋白亚基通过调控程序性坏死对抗H2O2诱导的小鼠精原细胞（GC-1 spg）氧化损伤的保护机制。方法:通过基因工程技术,将藻蓝蛋白亚基基因克隆至p GEX-4T-1质粒,转化至大肠杆菌E.coli BL21菌种,构建其原核表达载体,实现螺旋藻脱辅基藻蓝蛋白亚基在工程菌中高效表达。采用GST-Sefinose柱分析纯化目的蛋白
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目的:探究C-藻蓝蛋白（C-phycocyanin,C-PC）和脱辅基藻蓝蛋白亚基通过调控程序性坏死对抗H2O2诱导的小鼠精原细胞（GC-1 spg）氧化损伤的保护机制。方法:通过基因工程技术,将藻蓝蛋白亚基基因克隆至p GEX-4T-1质粒,转化至大肠杆菌E.coli BL21菌种,构建其原核表达载体,实现螺旋藻脱辅基藻蓝蛋白亚基在工程菌中高效表达。采用GST-Sefinose柱分析纯化目的蛋白,Western blot鉴定分析其纯度。采用600μM H2O2处理GC-1 spg细胞,构建氧化应激损伤模型。按细胞处理方式的不同分为5组:对照组、H2O2组、C-PC+H2O2组、GST-CPCβ+H2O2组、程序性坏死抑制剂（Nec-1）+H2O2组。CCK-8法检测细胞活性;2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）染色后荧光显微镜下检测各组细胞中产生细胞活性氧（ROS）情况;JC-1染色测定线粒体膜电势;Annexin V-FITC/PI双染检测细胞坏死率;Western blot法检测细胞中程序性坏死相关蛋白RIP-1、RIP-3和p-MLKL蛋白的表达水平。结果:1、将重组质粒转化至E.coli BL21中用IPTG成功诱导了重组蛋白的表达,并纯化获得脱辅基藻蓝蛋白α、β亚基。2、与对照组相比,H2O2组细胞存活率显著降低（P<0.01）;与H2O2组相比,C-PC+H2O2组、GST-CPCβ+H2O2组、Nec-1+H2O2组细胞存活率显著增高（P<0.01）,而GST+H2O2组、GST-CPCα+H2O2组无显著差异。3、荧光显微镜观察DCFH-DA染色结果显示,与对照组相比,H2O2组细胞内绿色荧光强度明显增高（P<0.01）;与H2O2组相比,C-PC+H2O2组、GST-CPCβ+H2O2组、Nec-1+H2O2组绿色荧光明显减弱,细胞内ROS水平显著降低（P<0.01）。4、荧光显微镜观察JC-1线粒体膜电位检测结果显示,与对照组相比,H2O2组线粒体膜电位显著降低（P<0.05）;与H2O2组相比,C-PC+H2O2组、GST-CPCβ+H2O2组、Nec-1+H2O2组线粒体膜电位显著升高（P<0.05）。5、Annexin V-FITC/PI双染结果显示:与对照组相比,H2O2组细胞坏死率增加（P<0.01）;与H2O2组相比,C-PC+H2O2组、GST-CPCβ+H2O2组、Nec-1+H2O2组细胞坏死率显著降低（P<0.01）。6、Western blot检测结果显示,与对照组相比,H2O2组RIP-1、RIP-3和p-MLKL蛋白表达水平显著升高（P<0.05）;与H2O2组相比,C-PC+H2O2组、GST-CPCβ+H2O2组、Nec-1+H2O2组显著降低了RIP-1、RIP-3和p-MLKL蛋白表达水平（P<0.05）。结论:C-藻蓝蛋白和脱辅基藻蓝蛋白β亚基可以通过抑制程序性坏死来对抗氧化应激引起的损伤,从而对GC-1 spg细胞起到一定的保护作用。
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