论文部分内容阅读
背景:尿道下裂是小儿常见的先天性泌尿生殖畸形,发病率高,危害性大,但尿道下裂的发病机制尚不清楚。尿道的胚胎发育过程和关键环节仍存在争议,尿道板融合过程中上皮-间质转化现象也有待进一步研究。目的:研究大鼠正常尿道的发育动力学及尿道板的融合机制。发现上皮-间质转化证据;探索尿道下裂的发生机制,为临床防治尿道下裂提供科学的实验依据。方法:1.健康清洁级SD孕鼠分别在孕15,16,18,19天麻醉后取雄性胎鼠阴茎,扫描电镜动态观察不同孕期的胎鼠阴茎外观,连续切片和HE染色观察尿道缝融合过程,免疫双标及透射电镜观察尿道缝形成过程中尿道板上皮细胞的生化及形态学变化。2.健康清洁级SD孕鼠随机分成3组:对照组,DEHP500暴露组和DEHP750暴露组,在孕12-18天分别给予玉米油、500mg/kg或750mg/kg DEHP,每天灌胃,于孕19天选取雄性胎鼠阴茎。扫描电镜和HE染色观察阴茎及尿道缝的发育,免疫荧光检测上皮-间质的表达,以及Western blot、PCR检测TGF-β/Smad信号通路的相关分子TGF-β1,Smad2/Smad3,Snail,Slug,EMT标志物E-cadherin,β-catenin,occludin,ZO-1,α-SMA,N-cadherin,Vimentin在尿道缝中的表达。3.在体实验中,无菌环境下选取正常孕16天雄性胎鼠阴茎,随机分为对照组,MEHP暴露组与TGF-β干预组,分别用PBS、MEHP、MEHP+TGF-β1处理48小时后观察阴茎生长情况,以及TGF-β/Smad信号通路的相关分子（同体内）在尿道缝中的表达。4.选取孕16天胎鼠阴茎随机分为对照组、DEHP组、TGF-β组和DEHP+TGF-β组,分别用PBS、MEHP、MEHP+TGF-β1处理24小时、MEHP处理24小时后TGF-β1处理24小时,观察阴茎生长情况。结果:1.从孕16天起,随着双侧的生殖结节向中线生长,两侧的尿道板在中线由底端向尖端逐渐融合形成尿道缝,最终形成尿道。2.在尿道缝形成的过程中,某些细胞共表达了上皮和间质的标志物,某些细胞共表达了上皮和凋亡的标志物。在透射电镜下,某些上皮细胞与周围的细胞间连接退化消失,伸出伪足,最后变成胞核大胞浆稀少的间质细胞,表现出间质细胞特征;某些细胞核膜皱缩,染色质边集,与周围的细胞间连接退化消失,出现凋亡表现。3.与对照组相比,DEHP孕期暴露会导致胎鼠发生尿道下裂,尿道缝融合受阻,融合过程中TGF-β1,p-Smad2/Smad3,Snail,Slug,间质细胞标志物α-SMA,N-cadherin和Vimentin表达减少,上皮细胞标志物E-cadherin,β-catenin,occludin和ZO-1表达增加（P<0.05）。在体实验中,给予TGF-β1干预后,TGF-β1,p-Smad2/Smad3,Snail,Slug,α-SMA,N-cadherin和Vimentin表达增加,E-cadherin,β-catenin,occludin和ZO-1表达减少（P<0.05）。4.MEHP可导致体外培养阴茎发育障碍,尿道开口更靠近阴茎根部。而TGF-β1因子能部分改善尿道的发育障碍。结论:尿道是通过尿道板从底端向尖端逐渐卷曲融合成尿道缝而形成。在融合塑形过程中,出现了上皮-间质转化和上皮细胞凋亡。尿道缝融合过程中的上皮-间质转化减少,引起尿道缝融合受阻,从而导致尿道下裂。TGF-β1可以干预这一过程,防止尿道下裂的发生。