第一部分ADSCs外泌体miR-21、miR-342通过caspase-3参与脑卒中神经损伤调节的作用研究研究背景脑卒中(Cerebral stroke)目前占脑血管病发病率约35%,40%的存活者遗留严重残疾,病死率高达50%以上,是威胁中、老年人健康的主要疾病之一,是世界范围内引起人类残疾和死亡的主要原因之一,是一个重要的公共健康问题。近年来临床中多采用手术清除血肿、去骨瓣减压术、动脉内膜剥脱术、脱水降颅内压、神经营养及高压氧等综合治疗手段,虽然能挽救部分病人的生命,但脑卒中存活者仍有很高的致残率。脑卒中后血肿及脑组织水肿的机械压迫和破坏可对神经系统细胞产生直接杀伤作用,而脑卒中后周围脑组织继发缺血缺氧会进一步导致神经元细胞等的坏死和凋亡,造成严重的神经功能缺失。已经开始有大量的研究试图阐明脑卒中神经损伤的病理机制以及脑卒中的治疗靶点,同时试图发现更好更快可以直接避免缺血性卒中损伤的治疗措施。如何减少脑卒中后神经元细胞的坏死和凋亡,是改善这类患者预后的关键。脂肪间充质干细胞(Adipose Derived Stem Cells,ADSCs)是一种从成体脂肪间充质中获得的干细胞,因其无明显的免疫排斥反应、亦可自体移植,具有多向分化潜能等优点,近年来成为干细胞移植研究的热点。ADSCs移植治疗多种疾病所致的神经功能缺损已获得有价值的研究进展。本人所在课题组前期已成功构建了 SD大鼠脑卒中模型,同时分离出ADSCs进行体外培养扩增,并诱导成神经元样细胞,然后注射到大鼠损伤脑组织局部,观察到受损脑组织局部不成熟神经元细胞增多、神经突触再生明显、细胞有丝分裂活动增强,局部神经组织损失面积减少,可促进大鼠的神经功能恢复。在综合大量动物实验的基础上,课题组又开展了自体ADSCs局部注射治疗脑卒中临床试验研究。研究结果证实在脑卒中患者血肿腔周围损伤的脑组织局部注射ADSCs治疗,可在近期(6个月)内有效改善患者的神经功能缺失,且效果优于静脉注射和蛛网膜下腔注射。但同时我们也发现ADSCs治疗组患者在12个月之后的神经功能评分与对照组比较无明显统计学差异,表明ADSCs治疗脑卒中后神经损伤远期效果较差,仍不能令人满意。如何提高移植后ADSCs神经修复效果是研究者面临的课题之一。这就提示我们要对ADSCs治疗脑卒中的作用机制进行深入研究,找到关键作用分子并进行靶向调控,是提高ADSCs临床治疗效果的关键。间充质干细胞在过去被认为能分化成不同类型的细胞,但是现在更多的研究关注间充质干细胞和其他细胞的相互作用和对其他细胞的影响,特别是研究和其他细胞的信息交流。近来通过细胞外囊泡进行信息交流吸引了更多的研究兴趣。有许多不同类型的分泌细胞外囊泡,它们在大小、细胞来源、生物合成、内容物和释放的生理环境都有不同。外泌体(Exosomes)是一种由细胞内溶酶体微粒内陷形成、直径在40-100nm的多囊泡体。它含有蛋白质、mRNAs和miRNAs等遗传物质,作用于靶细胞并调控相关靶基因表达,具有实现细胞间物质交换及信息传递等功能,参与体内多种病理生理过程。外泌体能够通过多种途径进行分离,通过电子显微镜进行特征描述和标记蛋白进行鉴定。目前研究认为,ADSCs移植治疗神经损伤性疾病,神经功能的改善主要获益于细胞的旁分泌机制,而外泌体是干细胞旁分泌效应中发挥主要作用的因子。干细胞来源的外泌体可提供生长因子等细胞保护因子,能够起到抗凋亡、促进血管生成、增强神经细胞分化及修复受损组织等多种作用。外泌体在ADSCs神经修复中的作用已经成为其作用机制研究的热点。已有大量研究证实脂肪间充质来源的干细胞可分泌外泌体,并在干细胞的生理作用中起到重要作用。在脑卒中相关外泌体研究中,Xin等报道ADSCs可通过分泌外泌体miR-133b被神经元及星形胶质细胞摄取后促进轴突生长。且ADSCs移植联合miR-133b过表达治疗对神经轴突可塑性及神经突触重塑方面效果优于单纯ADSCs治疗。该团队还首次用ADSCs源外泌体替代ADSCs治疗脑卒中动物模型,同样可改善脑卒中预后。然而,外泌体的内容物在不同的病理情况下发挥的作用不同,这种不同也许会导致靶细胞完全相反的命运。因此,研究在特定病理情况例如缺氧和缺血情况下外泌体的生物学功能将会大有收获。此外,本研究将尝试为缺血缺氧神经损伤的治疗提供新的理论依据。在外泌体的内容物中,有研究显示miRNAs调控缺血性脑卒中病理生理学结局中的重要过程。它是一组小(大约22核苷酸)、单链非编码RNA,在基因表达中具有重要的作用。miRNAs既能促进亦能抑制神经胶质细胞及脑血管内皮血细胞的凋亡,也能够调节急性脑缺血介导的脑卒中。但是脂肪间充质干细胞外泌体来源的miRNA是否可以在脑缺氧、缺血情况下参与神经胶质细胞及脑血管内皮细胞的凋亡调节过程还不是很清楚。在此研究中,我们探讨了脂肪间充质干细胞来源的外泌体对缺血、缺氧模型中神经胶质细胞及脑血管内皮细胞的保护作用,认为其机制主要是通过外泌体miR-21及miR-342对该两种细胞中caspase-3蛋白的调节来完成的。同时通过我们大量的研究工作亦可以为缺血性脑卒中提供潜在的细胞治疗策略。研究目的1.检测miR-21、miR-342在干细胞外泌体及脑卒中体外模型中的表达水平。2.分析miR-21、miR-342表达水平与脑卒中细胞凋亡间的关系。3.评估干细胞外泌体通过干预miR-21、miR-342的表达对卒中损伤的调控作用。4.研究miR-21、miR-342参与脑卒中损伤的调控机制及调节靶点。研究方法1.培养人源脂肪间充质干细胞,采用超速离心法成功提取外泌体并利用电子显微镜进行鉴定。培养人源神经胶质T98细胞及血管内皮细胞HCMEC,配置适当浓度氯化钴溶液(COC12)成功建立T98及HCMEC缺血缺氧模型,RNA-Seq、MTT及qRT-PCR方法分别检测、筛选差异表达miRNAs,并从中选取特异性高的 miRNA(miR-21、miRNA-342)。2.电子显微镜下观察T98及HCMEC细胞凋亡情况,并采用LP3000瞬时转染方法转染miR-21及miR-342的mimic及inhibitor,观察细胞凋亡及改善情况与miRNA表达的关系。3.间充质干细胞利用qRT-PCR方法验证差异表达miRNAs,将外泌体与缺血缺氧细胞模型共培养,观察细胞凋亡及改善情况。干扰干细胞miR-21及miR-342表达量,再次分离得到外泌体并共培养,通过qRT-PCR方法、Western Blot及流式细胞学技术方法观察细胞凋亡及改善情况。4.通过荧光素酶检测方法检测miR-21及miR-342在脑卒中损伤模型中的作用靶点及蛋白caspase-3,结合生物信息技术验证miRNAs及其靶基因作用的细胞信号通路,同时观察脑卒中细胞凋亡情况与caspase-3表达的相关性,再次验证miR-21及miR-342在脑卒中损伤模型中的作用靶点,尝试为脑卒中损伤的调节提供潜在的细胞治疗策略。研究结果1.miR-21、miR-342在脑卒中神经胶质T98细胞及HCMEC细胞中表达水平分析结果表明利用氯化钴溶液可以成功建立缺氧缺血模型,miR-21、miR-342在脑卒中神经胶质T98细胞及HCMEC细胞中表达水平具有明显特异性。脑卒中细胞模型建立后,miR-21表达降低(mean±SD,2.53±1.94),miR-342表达升高(mean±SD,2.57±1.95),miR-21与细胞凋亡程度呈负相关,miR-342与细胞凋亡情况呈正相关。2.分析miR-21、miR-342表达水平与脑卒中细胞凋亡间的关系脑卒中细胞模型建立后,miR-21表达降低,miR-342表达升高(mean±SD,2.57±1.95),miR-21与细胞凋亡程度呈负相关,miR-342与细胞凋亡情况呈正相关。3.评估干细胞外泌体通过干预miR-21、miR-342的表达对卒中损伤的调控作用。干细胞利用LP3000成功瞬时转染mi-R-21及miR-342的生物模拟物,并利用qRT-PCR检测到相应miRNA的表达改变。干细胞外泌体干扰miR-21及miR-342表达对脑卒中损伤发挥相应调控作用,干细胞外泌体miR-21过表达可以改善脑卒中损伤模型中细胞凋亡情况,miR-342过表达则起到促进细胞凋亡作用。4.研究miR-21、miR-342参与脑卒中损伤的调控机制及调节靶点。外泌体作为一个转运微粒,通过细胞间miRNA和蛋白的交换在细胞间的信息交流中发挥重要的作用,研究特定病理情况下分泌的具有潜在生物学功能外泌体中的miRNA等内容物是很有必要的。因此,我们选择了此前文献报道的12种miRNA,既包括缺血缺氧过程中的miR-24,miR-146,又包括少突胶质细胞凋亡过程中的miR-21,592,138,342等。在这些miRNA中,脂肪间充质干细胞来源的外泌体miR-21在经过缺氧处理后被显著下调,而miR-342显著上调。这提供了一个潜在的外泌体两种miRNA的共同靶点,其在缺氧处理后的T98及HCMEC细胞中也许会影响caspase-3的表达。我们检测了缺氧处理后的T98及HCMEC细胞中的miR-21及miR-342,结果显示miR-21被显著下调、miR-342显著上调,提示缺氧过程中miR-21、342的改变和caspase-3表达改变之间有可能存在联系。因此使用两种miRNA的抑制物进行过表达及低表达功能实验,结果显示miR-21的表达与caspase-3的表达水平呈负相关,miR-342与caspase的表达呈正相关。结论1.脑卒中损伤后神经胶质细胞及血管内皮细胞的凋亡进展与miR-21及miR-342的表达具有明显相关性。2.间充质干细胞来源的外泌体可通过miR-21及miR-342参与改变神经胶质细胞及血管内皮细胞的凋亡。3.间充质干细胞外泌体miR-21、miR-342通过caspase-3参与脑卒中损伤调节。意义本课题明确了我们能得出一个结论,即脂肪间充质干细胞源外泌体miR-21及miR-342、caspase-3有希望成为脑卒中治疗的潜在靶点。第二部分ADSCs外泌体通过miR-342-5p调控血管内皮细胞抗动脉粥样硬化改善脑卒中的作用研究研究背景脑血管疾病、心血管疾病和癌肿是导致人类死亡最常见的3类疾病。脑血管病的年人发病率在每十万人有150～200人,其中缺血性脑血管病约75%~85%、脑出血约10%~15%以及自发性蛛网膜下腔出血约5%~9%。脑梗死30天病死率约15%~33%,生存者均有程度不同的病残。虽然发达国家已大力开展对脑血管危险因素的防治,曾使脑血管病的发病率和死亡率在20世纪70年代有所降低,但在80年代初又有所回升。近年来,虽然神经科学在诊断、治疗以及基础研究上有很大的发展,但是脑血管病的治疗依旧是我们要面临的重大挑战。缺血性脑卒中见于很多种神经外科疾病的病理及生理过程中,如脑血管病、颅内肿瘤、脑外伤、术中暂时性血管阻断等;亦可见于心脏骤停、休克等全身性的病理过程。脑缺血可表现为不同的形式,例如局灶性和弥漫性脑缺血、永久性及暂时性脑缺血之分。但不论以哪种方式出现,脑缺血后的病理生理机制和生化改变基本相似,且与脑缺血的程度和持续时间高度相关。基本病理过程包括:能量衰竭、细胞离子平衡失调、酸中毒、钙内流、兴奋毒性作用和氧自由基介导的毒性作用等。研究表明,当颈动脉管腔狭窄程度<70%时,脑血流保持不变。可是,当狭窄≥70%时,管腔的横切面减少90%,即引起显著脑血流减少。动脉管腔内血栓形成或者栓塞是错综复杂的过程,受很多种因素相互作用:血液成分改变、血管壁内膜损伤、局部脑血流的特征例如流速、漩涡等。因颈动脉粥样硬化引起管腔高度狭窄进而导致脑供血不足是促成缺血性脑卒中的主要病因,因此颈动脉内膜剥脱术不仅可以增加CBF,而且可以消除潜在的脑血栓和栓塞风险进而达到防治缺血性脑卒中的目的。颈动脉粥样硬化,通常是由颈动脉壁上充满脂质的巨噬细胞积聚引起的,是脑血管疾病的主要潜在贡献者,并在全球范围内具有高发病率和高死亡率。一系列高脂血症引发的慢性炎症过程:包括修饰后的脂蛋白、单核细胞和T淋巴细胞与来自血管壁的细胞成分之间复杂的相互作用,均促进了动脉粥样硬化病变的形成。迄今为止,许多诊断技术已被用来评估脑血管疾病的风险和寻找其治疗方法,这些诊断技术通常分为侵入性和非侵入性:前者以侵袭性血管造影和光学断层扫描为例,后者以血液生物标志物、压力测试、CT和核扫描为例。值得注意的是,经过大量关于动脉粥样硬化发生的细胞及分子生物学方面的研究增强了人们对动脉粥样硬化发生的潜在危险因素及其临床特征的认识。因此,继续研究动脉粥样硬化形成的潜在机制,可有助于更好地防治这一系列的慢性疾病。动脉粥样硬化的发病机制可分为启动期、进展期和并发症期三个阶段。内皮细胞的损伤或功能障碍被认为是动脉粥样硬化斑块形成的关键原因。血管内皮细胞对血流紊乱的适应及对动脉分支部位血流冲击的易感性成为动脉粥样硬化发生的决定性因素。因此,寻找有效的方法来保护内皮细胞可能是预防动脉粥样硬化进展的有效策略。MicroRNAs(miRNAs)是一类小的非编码RNA,被认为是特异性信使RNA(mRNA)的重要转录后调节因子。近年来,大量文献研究发现,几种与促动脉粥样硬化和抗动脉粥样硬化相关的miRNA表达失调是动脉粥样硬化发生发展的关键因子。据报道,许多miRNAs在脂质代谢、炎症和动脉粥样硬化形成中发挥重要的调控作用:miR-19b和miR-144-3p参与脂质代谢调控,miR-92a和miR-155作为炎症的关键调控因子,miR-30c和miR-126-5p预防动脉粥样硬化。因此,靶向miRNAs可能会缓解动脉粥样硬化的发展。尽管已经报道了大量与动脉粥样硬化相关的miRNA,但在寻找新的或有价值的miRNA和探索其在动脉粥样硬化中的潜在生物学功能方面仍有许多工作要做。本研究旨在筛选动脉粥样硬化相关的miRNA,并初步探讨其可能的调控机制。首先,通过RNA测序对比分析动脉粥样硬化患者和相应健康对照组中差异表达的miRNA和mRNA。建立血管内皮细胞损伤模型。其次,我们的目标miRNA:miR-342-5p是在生物信息学分析和实验验证的基础上鉴定出来的。我们还评估了miR-342-5p对血管内皮细胞损伤模型凋亡的影响。通过一系列的生物信息学分析和实验证实,miR-342-5p被识别为动脉粥样硬化相关靶点。最后,我们对脂肪间充质干细胞(ADSCs)来源的外泌体进行了分离及鉴定,并研究了它们对血管内皮细胞损伤模型中mi R-342-5p表达的影响。总之,这项工作发现并鉴定了一个与动脉粥样硬化相关的miRNA(miR-342-5p),并发现了这个miRNA在动脉粥样硬化中发挥作用的潜在机制。研究目的1.检测人颈动脉粥样硬化标本与正常人颈动脉相比,miRNA、mRNA等的表达情况。2.建立体外内皮细胞损伤模型,采用WB、Hoechst和FCM等技术检测凋亡相关基因和功能,其中还检测了 miR-342-5p对内皮细胞损伤模型的作用。3.寻找并验证miR-342下游目标靶基因,研究抑制和过表达miR-342后对下游目标靶基因和蛋白表达水平的影响。4.分别干扰和过表达miR-342下游靶基因,研究其对血管内皮细胞抗动脉粥样硬化作用的影响。5.研究干细胞来源外泌体对miR-342-5p表达的影响。研究方法1.检测人颈动脉粥样硬化标本与正常颈动脉相比,miRNA、mRNA等的表达情况。利用RNA测序数据,通过一系列合适的分析工具来观察动脉粥样硬化样本中差异表达的miRNA和mRNA。利用火山图的方法对miRNAs和mRNAs在动脉粥样硬化组与正常组之间的不同进行差异化表达分析,其标准为|log2FC|>1 and P<0.05,Sanger Box将其结果进行可视化。基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集分析。在文氏图中,在miR-342-5p的重叠靶点中发现了 Hub基因。2.建立体外内皮细胞损伤模型,检测凋亡相关基因和功能,检测miR-342-5p对内皮细胞损伤模型的作用。MTT方法筛选适当浓度H202建立体外内皮细胞损伤模型,采用Hoechst染色试剂盒法及流式细胞术分析检测血管内皮细胞凋亡率,RNA分离和实时定量聚合酶链反应(q RT-PCR)检测并再次验证差异表达miRNA。3.研究干细胞来源外泌体对miR-342-5p表达的影响。ADSCs外泌体的分离和鉴定,提取干细胞外泌体与内皮细胞损伤模型共培养,利用RT-PCR和Western blot方法分别检测外泌体对miR-342表达的影响,免疫印迹分析(Western-blot)等技术对靶基因转录及蛋白表达水平的影响。分别干扰和过表达miR-342及靶基因。运用RT-PCR和Western blot验证干扰效率及过表达效率,检测血管内皮细胞凋亡情况的改善。研究结果1.通过RNA测序分析差异表达的miRNA和mRNA分别对3例动脉粥样硬化患者的粥样硬化斑块和2例意外车祸患者的颈动脉正常样本进行RNA测序。RNA-seq技术检测筛选差异表达miRNAs,火山图筛选条件为:|log2FC|>1,p<0.05;动脉粥样硬化标本中共有141个miRNA差异表达,其中上调68个,下调73个。血管内皮细胞在H202 0、1000、1500和2000 um时的凋亡率分别为2.6%、11.1%、20.5%和41.1%。western blot分析发现,随着 H202 浓度的升高,cleaved-PARP/PARP、cleaved-caspase3/caspase3、cytochrome C、p53 的表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。同时,随着H202浓度的升高,Bcl-2与BAX的比值呈下降趋势(P<0.05,P<0.01)。以上结果共同支持了血管内皮细胞病变模型的成功构建。2.目的miRNA miR-342-5p被识别并促进H2O2损伤的血管内皮细胞的凋亡根据log2FC值排序,筛选出前30位上调的miRNA,其表达谱热图如图3A所示。随后,10 个 miRNAs(即 miR-147b-3p、miR-378d、miR-10399-3p、miR-146a-5p、miR-146b-5p、miR-2277-5p、miR-342-5p、miR-181a-3p、miR-378a-3p 和miR-142-3p)被认为是候选,它们在RNA测序中排名第一,或据报道与动脉粥样硬化相关。在血管内皮细胞损伤模型中,10个miRNAs中,has-RNA-342-5p的相对表达量最高。随着H2O2(1000、1500或2000 uM)浓度的逐渐升高,检测到miR-342-5p的表达。显然,随着H202浓度的增加,这一 miRNA表达逐渐增强。将血管内皮细胞分别转染miR-342-5p mimic、inhibitor及其相应的NC,然后用1500um H202处理,结果表明miR-342-5p可以促进血管内皮细胞的凋亡。3.在H20损伤的血管内皮细胞中,PPP1R12B被鉴定为miR-342-5p的靶点通过聚类分析可以将表达模式相似的基因聚在一起,说明它们可能具有共同的功能或参与共同的代谢和信号通路。利用RNA测序得到的差异表达mRNA进行聚类分析在RNA测序中,有2694个mRNA下调,这240个基因分别来自三个数据库。因此获得了 25个基因,它们不仅是miR-342-5p的靶点,而且在动脉粥样硬化中也被下调。接下来,这25个基因被用于GO和KEGG富集分析。这25个重叠基因的相互作用首先通过STRING分析,然后导入到Cytoscape中。KEGG分析表明,在这些hub基因中,得分最高的PPP1R12B同时与血管平滑肌收缩和催产素信号通路相关。miR-342-5p可以抑制血管内皮细胞损伤模型中PPP1R12B的表达。上述证据表明,在H202受损的血管内皮细胞中,PPP1R12B是miR-342-5p的靶标。4.ADSCs源外泌体可抑制H2O2损伤血管内皮细胞中miR-342-5p的表达。将ADSCs分离培养,从ADSCs培养上清液中纯化的外泌体进行TEM表征。结果如图5B所示,外泌体为直径30～150nm的圆形膜囊。western blot检测作为外泌体常用标记蛋白的CD9、CD63和TSG101的表达水平。将外泌体加入浓度为1500um的H2O2损伤的血管内皮细胞中。随后用q RT-PCR检测miR-342-5p的表达。结果表明,在H2O2受损的血管内皮细胞中,ADSCs源外泌体抑制了 miR-342-5p的表达。结论1.间充质干细胞来源外泌体能够抑制miR-342-5p的表达,保护内皮细胞抗动脉粥样硬化,其主要抑制氧化应激诱导的线粒体凋亡信号通路来实现。2.在H2O2受损的血管内皮细胞中,PPP1R12B是miR-342-5p的靶标。3.由ADSCs源外泌体介导的miR-342-5p具有参与调控血管内皮细胞抵抗动脉粥样硬化的作用。意义我们的研究可能为动脉粥样硬化的发病机制提供更好的理解,并为动脉粥样硬化的潜在治疗靶点提供有价值的见解。