昆虫为了适应环境进化出各种各样的附肢,包括口器,触角,翅膀,足和外生殖器等。这些附肢的形态和功能各异,胸足和腹足的差异表型尤为突出。完全变态昆虫根据幼虫足的形态可分为多足型、寡足型和无足型昆虫。多足型昆虫幼虫的胸部着生3对胸足,腹部着生1至多对腹足。寡足型昆虫则只有胸足,无腹足。无足型昆虫幼虫各环节都无足。多足型昆虫的附肢在数量、位置和形态上都有很大差异。Hox基因家族是生物体内一类重要的发育调控基因,对昆虫附肢的发育起着重要的调控作用。但Hox基因及其控制的下游基因如何调控昆虫附肢多样性尚不清楚。家蚕作为鳞翅目昆虫,拥有丰富的遗传资源。其中有一类E群突变体,表现为附肢的过剩或缺失,与Hox基因簇的序列有关,因此可以利用E群突变体为材料来研究Hox基因及其下游靶基因调控家蚕腹肢发育和特化的机制。本研究以Dazao、E^Nk、E^N、E^Ca和E^Mc为实验材料,进行基因组测序,并利用定量PCR,原位杂交技术确定Antp,BX-C（Ubx、abd-A和Abd-B）基因在五个品系的中的表达情况。根据转录组测序筛选可能影响腹肢形态特化的候选基因,并利用过表达手段鉴定候选基因的功能,进而探索家蚕腹肢发育和特化的分子机制。获得的主要结果如下:1.E^N、E^Nk、E^Ca、E^Mc突变体基因组测序对E^N、E^Nk、E^Ca、E^Mc4个突变体的基因组进行二代和三代测序,结果发现:与Dazao基因组数据比较,Antp、abd-A、Abd-B基因的编码区在4个突变体中均无突变或存在单碱基突变,但编码的氨基酸序列不发生改变;Ubx基因编码区在E^N、E^Ca、E^Mc突变体中存在几处单碱基突变,氨基酸序列不发生改变,而在E^Nk突变体中插入一个碱基G,导致编码的氨基酸序列改变。我们调取家蚕野生型Dazao和4个突变体中Antp、Ubx、abd-A、Abd-B基因3’端和5’端调控区10k的序列做多序列比对分析。结果发现:与正常Dazao相比,在E^N突变体中,Antp和Ubx基因5’端调控区分别插入226bp和缺失273bp碱基;abd-A基因3’端和5’端分别插入1580bp和195bp碱基;Abd-B基因3’端插入200bp碱基。在E^NK突变体中,Antp5’端插入226bp碱基,Ubx基因5’端插入273bp碱基,abd-A基因3’和5’端分别插入128和195bp碱基;Abd-B基因5’端插入37bp碱基。在E^Ca突变体中,Ubx基因5’端有5处14-33bp碱基插入;abd-A基因在3’端有4处116-1085bp碱基插入,3处34bp-159bp碱基缺失;Abd-B基因5’端插入37bp碱基;在E^Mc突变体中,Ubx基因5’端插入33bp碱基,abd-A基因3’端和5’端分别存在128bp和195bp碱基的缺失和插入,Abd-B基因5’端插入37bp碱基。这4个Hox基因在编码区的变异会导致其功能缺陷,在调控区的插入或缺失会导致相应基因转录水平的改变,从而造成突变体腹肢表型异常。2.E^N、E^Nk、E^Ca、E^Mc突变体中Antp、BX-C基因表达检测以发育5天的胚胎为模板做荧光定量PCR,结果显示,相比于正常Dazao,Antp在E^N、E^Nk突变体中显著上调表达,Ubx在E^N中下调表达,在E^Nk突变体中显著上调表达,abd-A和Abd-B在E^N、E^Nk中均下调表达。虽然Ubx在E^Nk中上调表达,但其编码区插入一个碱基导致Ubx基因无义突变。因此,我们推测,Antp基因的上调表达,Ubx、abd-A和Abd-B基因的下调表达使得E^N、E^Nk突变体腹节着生似胸足的腹足。在E^Ca、E^Mc突变体中,Antp和Ubx基因上调表达,abd-A和Abd-B均下调表达,我们推测Ubx的上调和abd-A,Abd-B的下调导致E^Ca、E^Mc突变体腹部不长足。这暗示Antp、BX-C表达量的改变可能影响E^N、E^Nk、E^Ca、E^Mc突变体腹肢表型修饰。3.E^N和E^Ca突变体胚胎中Antp、BX-C基因的表达部位利用原位杂交技术分析Antp、BX-C在Dazao,E^N和E^Ca突变体发育5天胚胎中的表达部位。结果显示:在野生型Dazao中,Antp表达于T1-T3胸节,促进胸足的发育,在E^N中除了尾节的其他体节均有表达,在E^Ca中异位表达于后胸和腹节;Ubx在Dazao中表达于后胸和前腹节,抑制腹足的发育,在E^N中表达信号弱,而在E^Ca中异位表达在A1-A6腹节;abd-A在Dazao中表达于A3-A6腹节,促进腹足的发育,Abd-B表达于后腹节,抑制后腹节腹足的发育,而abd-A和Abd-B在E^Ca和E^N中检测不到表达信号或仅有极弱的表达。基于以上结果,我们推测:在E^N突变体中,Antp在腹节的异位表达以及Ubx、abd-A和Abd-B的下调表达使得E^N突变体腹部着生似胸足的腹足;在E^Ca突变体中,Ubx异位表达在A1-A6腹节抑制腹足的生长,且abd-A下调表达最终导致E^Ca突变体腹部不长足。4.E^N、E^Nk、E^Ca、E^Mc突变体转录组测序为了进一步解析Hox基因下游对家蚕腹肢表型起修饰作用的基因,我们利用Dazao,E^N、E^Nk、E^Ca、E^Mc突变体发育60h胚胎的腹部区域作为材料,进行转录组测序,筛选腹肢修饰相关基因。通过差异基因聚类分析,我们发现:与E^Ca和E^Mc相比,Dazao、E^N和E^Nk中有32个上调表达和360个下调表达的基因,推测它们可能是影响家蚕腹部是否长足的基因。与其他三种品系相比,E^N和E^Nk中有8个共同的上调表达的基因,这些基因可能在胸足的特化中发挥作用。Dazao与E^N、E^Nk、E^Ca、E^Mc比较,有81个上调表达的基因,推测它们可能与家蚕腹足发育有关。其中,发现了abd-A基因,证实了其在腹足发育中的作用。将这些差异基因进行GO和KEGG富集分析,并做功能注释,筛选到一些可能参与家蚕腹肢表型修饰的基因。5.候选基因BmSp9基因的功能初探根据上述转录组数据,我们筛选到了BmSp9基因,它在E^N和E^Nk中相对于E^Ca、E^Mc和Dazao上调表达,推测其可能参与家蚕胸足形态的特化。通过氨基酸序列比对,发现BmSp9是果蝇DmSp1的同源基因。为了验证BmSp9在家蚕腹肢发育中的作用,我们构建了piggyBac-IE1-BmSp9-SV40过表达载体,并将其显微注射进野生型Dazao的蚕卵,经过饲养并筛选到G1代转基因阳性个性,但并未观察到明显表型,可能是因为转基因位点还未纯合,有待后续进一步研究。