沙门氏菌属及其主要血清型的快速检测研究

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本研究建立沙门氏菌及其主要血清型的环介导恒温扩增(Loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)方法,实现对沙门氏菌及其主要致病血清型的快速分型检测。通过序列同源性比较,确定沙门氏菌的属特异基因invE,及肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌三种血清型的血清型特异基因lygD、STM4495、fliC,并分别设计、合成特异LAMP扩增引物,均包括内引物对(FIP、BIP)和外引物对(F3、B3)。分别挑取沙门氏菌三种血清型纯培养单菌落,用煮沸法提取DNA模板。通过优化LAMP法操作中的各种条件,确定该法的最佳反应环境。分别选择肠炎、鼠伤寒、猪霍乱沙门氏菌标准株及几种非沙门氏菌菌株进行LAMP扩增,判断所设计的沙门氏菌属LAMP扩增引物和三种血清型引物的特异性。分别将纯培养2d的三种血清型菌株挑取单菌落,以生理盐水10倍梯度逐步稀释菌液,分别取各稀释菌液100μL进行平板计数,同时分别取各稀释菌液1mL提取DNA模板进行LAMP扩增检测LAMP法灵敏度,扩增产物分别采用凝胶电泳和直接在产物中加入SYBR-Green I染料两种方法检测。同时对提取的DNA模板进行PCR扩增,比较两种方法的灵敏度强弱。根据沙门氏菌各血清型的传播来源不同,分别选择不同的无菌食品样本人工添加目的菌种进行LAMP法扩增。结果显示采用沙门氏菌属特异性引物进行LAMP扩增,能特异的检出沙门氏菌三种血清型,而非沙门氏菌不能检出;分别采用三种血清型特异性引物进行扩增,三种血清型之间无交叉反应,且非沙门氏菌均不能检出,表明所设计的沙门氏菌属和血清型扩增引物特异性强。LAMP法针对invE基因细菌纯培养液检出限为2.0×10~1CFU/mL,PCR法检出限为2.33×10~3CFU/mL,而三种血清型细菌培养液LAMP法检出限分别为2.33×101CFU/mL、1.67×10~1CFU/mL、1.33×10~1CFU/mL,PCR法检出限分别为1.33×10~3CFU/mL、2.17×10~2CFU/mL、1.67×10~2CFU/mL,表明与PCR法相比,LAMP法的灵敏度高101~102倍。沙门氏菌属及三种血清型模拟样本检出限分别为1.67×10~1CFU/mL、2.67×10~1CFU/mL、2.0×10~1CFU/mL、2.0×10~1CFU/mL,基本与细菌纯培养液检出限一致,表明食品样本中潜在的干扰物质对LAMP反应体系影响不大。综上所述,LAMP法反应灵敏度高、特异性强,可用于食品中沙门氏菌及其主要血清型的快速检测。
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