【摘 要】
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禽白血病是由禽白血病病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的总称,J亚群虽然被发现的时间最晚,但其传染性和致病性都比其它亚群高,目前尚无有效的疫苗来防治,只能不断的淘汰阳性鸡,从而达到消灭本病的目的。实验室检测病原常用的分子生物学方法主要包括PCR技术、巢式PCR技术和荧光定量PCR技术,这3种方法虽然具有一定的作用,但是比较费时费力,对于操作人员的要求较高,无法满足简单快速诊断的要求。LAMP技术是一种全
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禽白血病是由禽白血病病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的总称,J亚群虽然被发现的时间最晚,但其传染性和致病性都比其它亚群高,目前尚无有效的疫苗来防治,只能不断的淘汰阳性鸡,从而达到消灭本病的目的。实验室检测病原常用的分子生物学方法主要包括PCR技术、巢式PCR技术和荧光定量PCR技术,这3种方法虽然具有一定的作用,但是比较费时费力,对于操作人员的要求较高,无法满足简单快速诊断的要求。LAMP技术是一种全新的基因扩增方法,只需把模板、引物、酶、基质等共同置于一定温度下,经过一个步骤即可反应完成,根据扩增产物的有无即可对靶基因序列的存在与否做出判断。但是受制于该技术假阳性率高、结果判定需要开盖、可视化程度不高、操作过程可重复性较差等因素,LAMP技术目前很难进行推广使用,极大限制了该检测方法的使用范围。本研究拟结合该技术的最新研究趋势闭管操作与结果的可视化,建立一种检测J亚群禽白血病病毒的LAMP可视化检测方法。本研究首先对J亚群的禽白血病病毒SD0101株在DF-1细胞上进行扩增培养,使用EILSA方法和IFA技术来检测病毒在细胞上的增殖,根据Gen Bank已登录的J亚群禽白血病病毒gp85基因序列,人工合成后制备其DNA质粒模板ALV-J-gp85-p MD18-T,并用核酸蛋白分析仪测定了构建的阳性重组质粒ALV-J-gp85-p MD18-T的浓度,通过公式换算出拷贝数。使用在线设计软件设计出了针对J亚群禽白血病病毒的特异性LAMP引物,分别对引物比例、甜菜碱浓度、镁离子浓度、d NTP浓度、Bst酶浓度、反应温度、反应时间进行优化,筛选出最佳的ALV-J LAMP反应条件,最后在反应体系中加入防污染试剂和可视化试剂方便对反应结果进行判定,整个试验过程全程无需开盖,降低了污染的可能,保证了实验结果的准确性。通过与禽白血病病毒其他亚群的区分试验、特异性试验、灵敏性试验、重复性试验、临床样品的检测试验来检验本方法的可行性。试验结果表明,用IFA方法和ELISA方法证明了SD0101毒株在DF-1细胞上发生了增殖,构建的阳性质粒模板ALV-J-gp85-p MD18-T浓度为166 ng/μL,换算得到拷贝数为4×1010copies/μL,通过对ALV-J LAMP反应体系的优化,确定了ALV-J LAMP反应最佳内外引物比例为8:1、甜菜碱浓度为4 M、镁离子浓度为6 m M、d NTP浓度为1.4 m M、Bst酶浓度为400 U/m L、最佳反应温度为64℃、最佳反应时间为54 min。通过规范化操作以及在反应体系加入1.4 m M的d UTP和0.01 U/μL的热敏UDG来减少LAMP反应产生的污染,最后在反应体系中加入1～3μL的SYBR系列荧光染料或NEB酚红试剂来对结果进行判定,加入SYBR荧光染料的阳性结果在紫外灯下呈现黄绿色,在体系中加入酚红试剂的阳性结果用肉眼观察呈现黄色。本研究建立的ALV-J LAMP可视化检测方法不与除J亚群外的其它禽白血病主要亚群发生交叉反应,同时也不与其它常见的禽类肿瘤性疾病发生非特异性反应,敏感性实验结果表明,ALV-J LAMP可视化方法比传统PCR方法敏感100倍,可以检测出的最小拷贝数为4×10~1copies/μL,检出的极限量为0.166 fg/μL。批内重复性试验和临床样品的检测结果也表明该方法具有良好的重复性,分别用ALV-J LAMP可视化检测方法和传统PCR方法对疑似禽白血病病毒感染的样品进行检测,两种检测方法的符合率为100%。综上所述,通过闭管操作、反应条件的优化和可视化试剂的使用,成功建立了针对J亚群禽白血病病毒的LAMP可视化检测方法,该方法具有成本低、特异性好、检测结果便于观察等优点,在实际使用中具有广泛的应用前景。
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