奶牛乳房炎是一种主要由病原微生物引起的奶牛疾病,在世界各地都有发生。感染后奶牛奶产量的下降,甚至是慢性感染牛的淘汰,都给奶牛养殖业造成巨大的经济损失。病原微生物能穿透乳头管,并在泌乳腔中繁殖,进而引起乳房炎。多数乳房炎病例是由一个相对小群体的细菌造成的,包括金黄色葡萄球菌,乳房链球菌,大肠杆菌和隐秘化脓杆菌等。奶牛乳房炎指的是乳腺的炎症,炎症严重程度取决于病原体和宿主反应。这些病原微生物会发生进化,并通过许多战略抵制抗生素的作用和得以生存。小菌落突变株和生物膜的形成,以及介导灭活酶的基因表达,都是细菌逃避抗生素作用的生存策略。进化后的细菌常常能引起持续感染的奶牛乳房炎。在本研究中,我们从临床与亚临床型奶牛乳房炎(第二章与第三章),慢性与复发性奶牛乳房炎(第四章)分离出金黄色葡萄球菌和隐秘化脓棒状杆菌,并对其毒力因子,生物膜的形成,小菌落突变体(small colony variants,SCVs)的形成,耐药基因,以及耐药特征进行了检测与分析。研究一：本文着重研究35株在两个奶牛场内分离到的金黄色葡萄球菌的流行情况,测定金黄色葡萄球菌的耐药性,尤其是青霉素和甲氧西林,并研究金黄色葡萄球菌菌株的毒力因子和生物膜的形成的关系、临床症状的严重性、持久性与乳房内感染的关系。从151个临床和亚临床性的奶牛乳房炎牛奶样品中分离出35株金黄色葡萄球菌,再利用组织培养板和刚果红平板测定金黄色葡萄球菌生物膜的形成,35株金黄色葡萄球菌只有30株在体外培养中形成生物膜,而31株在刚果红平板中形成了生物膜。然而,这35株菌被发现携带有icaA与icaD基因。所有测试菌株均对头孢噻吩、环丙沙星、利福平敏感,而其中有15株产β-内酰胺酶,并携带blaZ基因。研究二(第三章)：本研究的目的是探讨病原微生物的形态学变化、生物膜形成、毒力因子、细胞内的细胞病理学和耐药性。从275个临床型和亚临床型奶牛乳房炎的乳样中分离出50株隐秘化脓杆菌,用组织培养板法测定隐秘化脓杆菌的生物膜形成,结果表明90%隐秘化脓杆菌产生物膜,并且所有菌株都携带plo和cbpA基因。胞内试验结果显示,4株不同的隐秘化脓杆菌对受感染的牛乳腺上皮细胞造成了不同程度的细胞病理学影响。14种抗生素的最小抑菌浓度试验表明,它们对利福平有高敏感性(96%),而对复方新诺明(90%)和杆菌肽(98%)有较高抵抗力。四环素和大环内酯类耐药基因之间没有显著关系,相应的耐药表型已在研究中列出。研究三(第四章)：本研究中从一个持久型奶牛乳房炎病例中分离出金黄色葡萄球菌小菌落突变株(SCV102),并对其进行了鉴定,这是在中国首次报道奶牛乳房炎源性的金黄色葡萄球技小菌落变异株。从5个金黄色葡萄球菌慢性感染的病例中获取30份样品,分离出八株金黄色葡萄球菌菌株,从中分离到一株小菌落突变株(SCV102)。SCV102表现为胸苷营养缺陷型,并且生长缓慢。SCV102在人乳腺上皮细胞(HBL100细胞系)内能持续存在,表明与亲本菌株相比,它细胞病理学作用较小。SCV102分离株和亲本菌株金黄色葡萄球菌101有相似的耐药模式。与此相反,SCV102的氯霉素和磺胺二甲氧嘧啶最小抑菌浓度值均比金黄色葡萄球菌101要高得多。研究四(第4章)：本研究中首次对奶牛乳房炎源性隐秘化脓杆菌小菌落突变体(T.pyogenes small colony variants,T. pyogenes-SCVs)进行了分离和鉴定。从不同的奶牛场收集到的40个慢性、复发性乳房炎病例中分离出12株隐秘化脓杆菌。四株T. pyogenes-SCVs在10次传代后显示出高稳定性,所以把它们用于进一步研究,同它们的野生型(WT)菌株进行比较。T. pyogenes-SCVs为维生素K2(甲萘醌)营养缺陷型,经RAPD试验后发现它们与野生型菌株有非常相似的遗传多样性。T. pyogenes-SCVs的生长曲线表现出较慢的生长速度,与野生型菌株相比有更长的停滞期。它能在牛乳腺上皮细胞(BMEC细胞系)内持续存在,表明T. pyogenes-SCVs有更高的存活率。此外,药敏试验表明,T. pyogenes-SCVs与野生型菌株相比有更高的MIC值。此研究促进了对隐秘化脓杆菌和金黄色葡萄球菌临床本质的理解,对一些病原感染所致乳房炎病例的病原发生学研究或许有重要帮助。