研究背景：乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,已严重影响了妇女身心健康甚至危及生命。据WHO统计,20世纪以来乳腺癌的发病率在世界各地均有上升趋势。2009年全世界每年有120万妇女患乳腺癌,50万妇女死于乳腺癌,其发病率以每年2%～8%的速度递增。北美和西方发达国家是乳腺癌的高发区,占女性恶性肿瘤发病的第1、2位。亚洲地区乳腺癌发病率虽然不高,但增长速度很快,且发病年龄有年轻化趋势。在我国,女性患乳腺癌的比例为35～45/10万人,占全身恶性肿瘤的7%-10%,发病率以每年3%的速度递增,在北京、天津、上海等城市均已跃居女性恶性肿瘤的第1位。肿瘤干细胞假说是近年来提出的一种新理论,为癌症的治疗方法提供了新的思路。肿瘤干细胞假说认为肿瘤组织中只有很小一部分细胞具有引起肿瘤发生、维持肿瘤生长、保持肿瘤异质性的能力。如果传统治疗忽略了这部分细胞,即使其他大部分肿瘤细胞都被消灭,仍然会面临着复发的可能。这一小部分细胞被称为肿瘤干细胞(Cancer stem cells, CSCs)。肿瘤干细胞具有自我更新、无限增殖及分化潜能。其常见分离方法有：表面标志分选；流式细胞仪侧群筛选方法；悬浮培养；醛脱氢酶ALDH(aldehyde dehydrogennase)法。表面标记、侧群筛选及ALDH等方法虽然能分离出肿瘤干细胞,但无法使肿瘤干细胞在体外得到扩增,维持干细胞特性。对于肿瘤干细胞特性验证,NOD/SCID小鼠体内成瘤实验不仅能验证肿瘤干细胞高致瘤特性,还能反映肿瘤自我更新及无限增殖能力,因此成为了肿瘤干细胞验证“金标准”。2003年Al-Hajj等人首次从人胸腔积液中分离出乳腺癌干细胞,流式细胞仪分析及NOD/SCID小鼠体内成瘤实验证实CD44+CD24-/low为其特异性表面标记。随后Ponti等人采用悬浮培养方法成功富集乳腺癌干细胞,并在体外维持干细胞特性。进一步利用NOD/SCID小鼠体内成瘤实验证明了CD44+CD24-/low表面标记作为乳腺癌干细胞的可行性。随着对肿瘤干细胞的深入研究,Bao[4]等研究证实脑胶质瘤CD133+肿瘤干细胞由于高效的DNA损伤修复能力而对放疗更加抵抗。谢等人克隆形成实验证实悬浮培养富集的乳腺癌干细胞比普通贴壁培养乳腺癌细胞有更强的放疗抵抗能力。Phillips等同样证实MCF-7细胞系中乳腺癌干细胞具有放疗抵抗特性。更重要的是早期研究已经表明,射线对于肿瘤细胞的杀伤作用主要是损伤肿瘤细胞的DNA,受射线损伤的细胞会停滞于细胞周期的某些时相进行DNA修复,如果修复成功,细胞进入下一个周期。总之,悬浮培养能有效富集MCF-7细胞系中乳腺癌干细胞。CD44+CD24-/low表型标记细胞为可靠的乳腺癌干细胞表面标记物。流式细胞仪表面标记分选法能检测悬浮培养所富集的肿瘤干细胞,体内成瘤实验能很好地验证所获得的乳腺癌干细胞。目前尽管有脑胶质瘤干细胞及乳腺癌干细胞放疗抵抗证据,有相关的放疗抵抗机制研究,但是对于乳腺癌放疗抵抗特性与细胞周期是否相关,国内外尚未见报道。因此,本研究利用悬浮培养方法富集MCF-7中乳腺癌干细胞,初步探讨MCF-7细胞系中乳腺癌干细胞与细胞周期相关性。研究目的：1)探讨悬浮培养富集MCF-7细胞系中乳腺癌干细胞的可行性,并验证所获得的干细胞特性。2)通过克隆形成实验了解所富集乳腺癌干细胞放疗抵抗特性。3)进一步探讨乳腺癌干细胞放疗抵抗与细胞周期之间的关系。实验方法：1)MCF-7细胞的悬浮球培养贴壁培养的MCF-7细胞经消化后重悬于不含血清的DMEM/F12培养基,37℃、5%CO2培养箱中静止培养,每隔一天加1ml新鲜培养基。待微球囊形成后,以400目高压灭菌后的不锈钢细胞筛过筛悬液,收集未通过滤网的微球囊,机械吹打成单细胞悬液,按传代方法重新以克隆密度培养于无血清悬浮培养体系,约每隔一周传代一次。2)流式细胞仪检测CD44+CD24-/low标记的乳腺癌干细胞比例收集细胞贴壁培养细胞第4天和无血清培养第4天细胞,消化或机械吹打为单细胞悬液,离心弃上清,PBS洗涤两次,以PBS调整细胞密度为1×106个/100μl。实验组加入CD44-FITC和CD24-PE标记的单克隆抗体,对照组加入相应的同型对照抗体,阴性对照组不加任何抗体,4℃避光孵育,30min后加5mlPBS漂洗去除未结合的抗体,1小时内用流式细胞仪检测,常规检测三次。3)小鼠体内成瘤实验收集贴壁培养、微球囊细胞,分别制成单细胞悬液,加5mlPBS洗涤两次以去除残留血清,最后细胞以5×106cells/ml,5×105 cells/ml, 1×104 cells/ml,5×103 cells/ml浓度重悬于DMEM/F12:matrigel(1:1)混合液,细胞悬液皮下注射于4周龄雌性NOD/SCID小鼠的胁腹部,注射体积为100μl,即接种细胞数量分别为5×105cells/只,5×104cells/只,1×103cells/只,5×102cells/只。每只小鼠同时大腿肌注0.05mg17β雌二醇,每周注射一次,12周后去除肿瘤。4)克隆形成实验将贴壁培养、微球囊细胞分别照射后的细胞置于37℃,5%CO2的孵育箱进行培养,连续培养14天。终止培养后常规以PBS缓冲液洗涤细胞2次,经甲醇固定,采用1%的结晶紫染液染色后,在显微镜下计算细胞>50个的细胞克隆数,计算克隆形成率(克隆形成率=生成的克隆数/接种细胞数×100%)和存活分数(survival fraction,SF=受照射细胞的克隆形成率/对照组细胞克隆形成率×100%)。5)细胞周期检测将贴壁培养、微球囊细胞制成单细胞悬液,计数每份标本细胞量达1×106/uL,离心后去上清液,加入-20℃预冷的70%乙醇固定,上机前离心去上清液,加入5mlPBS室温下水化15min,再次离心去上清,加细胞周期检测试剂,4℃避光染色30 min,上机检测细胞周期各个时相所占百分比。6)蛋白检测根据德国Novagen公司全蛋白提取试剂盒说明书,提取悬浮培养和贴壁培养细胞2Gy照射,24h后细胞总蛋白,BCA浓度检测蛋白浓度,细胞总蛋白与上样缓冲液按2：1混合,煮沸5mmin。经SDS-PAGE分离,电转到硝酸纤维膜上,孵育一抗、二抗后暗室显影曝光,Gel2000成像系统(Bio-Rad)分析灰度。7)统计学方法实验结果应用SPSS13.0软件,剂量资料采用均数±标准差,以方差分析及Welch(方差不齐)进行统计分析,p<0.05为差异有统计学差异。实验结果：1)悬浮培养结果MCF-7细胞在无血清培养基中呈不规则球形,囊形态不规则,球体之间相互间隔,传代后仍然能不规则球体。2)CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞含量检测结果为验证悬浮培养对肿瘤干细胞的富集作用,我们采用流式细胞仪对贴壁培养和悬浮培养球囊中肿瘤干细胞含量进行分析。CD44+CD24-/low细胞含量在贴壁培养和悬浮培养球囊中分别为(8.50±1.25)%、(84.26±4.56)%,统计分析显示两者有显著差异(p<0.01)。3)体内成瘤结果贴壁培养、微球囊细胞分别制成单细胞悬液,按5×105cells/只,5×104cells/只,1×103cells/只,5×102cells/只接种于4周龄雌性NOD/SCID小鼠的胁腹部皮下脂肪垫处,第12周后观察。在悬浮培养中其成瘤情况为：3/3、4/4、6/6、7/8；贴壁培养分别为：3/3、3/4、1/6、0/8。4)克隆形成结果球囊细胞及贴壁培养的MCF-7细胞经5个不同剂量照射后培养14d。按单击多靶模型拟合各剂量点生存率：SF2Gy-monolayer=0.716±0.059, SF2Gy-mamosphere=0.903±0.057 (p<0.05); D0-monolayer=1.220±0.113, D0- mamosphere= 3.063±0.637 (p<0.05); Dq-monolayer=2.653±0.474, Dq- mamosphere =4.950±0.496 (p<0.001)。5)细胞周期检测结果未照射贴壁细胞G0/G1、S和G2期细胞比例分别为0.587±0.113、0.339±0.099和0.073±0.176；照射后24h贴壁培养各周期比例为0.708±0.132、0.236±0.126和0.057±0.032。未照射球囊细胞周期比例分别为0.508±0.106、0.282±0.166和0.210±0.080；球囊照射后24h各周期比例：0.335±0.083、0.191±0.316和0.474±0.074。经统计分析显示,贴壁细胞照射前后各期无明显差异；球囊细胞群照射后G0/G1和S期无明显差异,而G2期细胞含量明显增多(p<0.05)。6)pCDC25C蛋白检测结果Western blotting检测结果显示在相对分子质量60,000处显示一特异性条带。相对积分吸光度值经统计分析后显示：在贴壁培养组CDC25C及pCDC25C(ser216)在前后表达均无明显差异；在悬浮培养组CDC25C放疗前后无明显差异,pCDC25C(ser216)在放疗后表达量明显增加(p<0.05)。7)统计学方法实验结果应用用SPSS13.0软件,计量资料采用均数±标准差表示,以one-way ANOVA及Welch(方差不齐)进行统计分析,P<0.05为差异有统计学意义。结论：1)MCF-7细胞系在无血清悬浮培养中能形成球囊,球囊细胞成瘤能力较高,球囊中CD44+CD24-/low细胞含量可达84%。为下一步的研究提供了可靠的体外实验模型。2)克隆形成实验结果证实,悬浮培养所富集的MCF-7中肿瘤干细胞有明显的辐射抵抗特性。3)流式细胞仪对悬浮培养和贴壁培养细胞放疗前后细胞周期分析显示,悬浮培养乳腺癌干细胞放疗后G2期阻滞明显高于贴壁培养。