第一章：鲍曼不动杆菌感染临床特点[研究背景]鲍曼不动杆菌是一种非发酵乳糖的,需氧的,革兰氏染色阴性的多形不动杆菌。近几十年来,由鲍曼不动杆菌诱发的感染日益增多。鲍曼不动杆菌是机会性致病菌,在免疫能力缺损的住院患者中,发病率高。由于鲍曼不动杆菌具有极强的耐药能力,近年来,医学界把鲍曼不动杆菌定义为人类红色预警病原体。鲍曼不动杆菌的耐药能力得益于其具有多种耐药机制,这些机制包括：产生β内酰胺酶,氨基糖苷类修饰酶,喹诺酮类作用位点突变,以及多种多样的外排泵机制和外膜蛋白的变异。所有这些均可导致细菌高度耐药,从而使得抗菌药物的选择严重受限。鲍曼不动杆菌可引起全身各系统感染,这些感染严重程度不同,患者预后也有很大差异。主要感染类型包括：医院获得性肺炎,社区获得性肺炎,外伤及战争伤,脑膜炎,尿路感染等。鲍曼不动杆菌为机会性致病菌,在多种原发病基础上合并该菌感染,合并感染可以导致患者的生存率下降。我院为部级三级甲等医院,收治来自省内以及临近省市的疑难危重患者,患者往往病情重,鲍曼不动杆菌感染发病率高,但目前尚无临床研究对我院鲍曼不动杆菌感染的总体特点进行统计分析。本研究旨在分析医院获得性鲍曼不动杆菌感染的人群分布,菌株耐药性分析以及感染鲍曼不动杆菌患者的预后评估。并进一步探讨了感染高度耐药菌株与感染普通耐药菌株的人群基础状况以及预后的差异。为临床预防以及经验性治疗鲍曼不动杆菌感染奠定基础,并为鲍曼不动杆菌感染抗菌药物选择的研究提供方向。[研究方法]本研究收集了2014年1月至2015年12月间,山东大学齐鲁医院各临床科室诊断为鲍曼不动杆菌感染的病例共842例,入选标准包括：临床标本中分离出鲍曼不动杆菌；有相应的感染症状、体征、影像学表现；有相应治疗。其中女性患者214人,男性患者628人。应用exel记录以及SPSS22.0统计软件进行分析。统计分析了鲍曼不动杆菌感染的人群的总体特点,包括性别,年龄,科室分布,以及感染菌株耐药情况,患者基础状况以及预后分析,并分析比较了感染高度耐药菌株与感染普通耐药菌株的人群基础状况以及预后的差异。[研究结果]鲍曼不动杆菌感染的患者为842人,其中男性患者628名,女性患者214名。鲍曼不动杆菌感染的患者中,老年人所占比重最高,为62.47%,少年组最低,为1.66%。在所有842例病例中,多次分离出鲍曼不动杆菌的病例占多数,共560例,占总数的66.51%。2014年间鲍曼不动杆菌感染的患者为409例,2015年为433例。2014年各月份病例数分布不规律,无明显高峰低谷。2015年可见两个明显高峰期,即2014年12月到2015年1月,以及2015年3月到7月。鲍曼不动杆菌感染患者分布于我院40个临床科室中,其中ICU病房患者最多,其次为保健病房,再次为呼吸监护室,以及呼吸科病房。分离出鲍曼不动杆菌菌株的各种临床标本,痰液最多,单纯从痰液中分离出菌株的患者为663例,占总数的78.74%。分离出高度耐药菌的病例所占比率为71.02%。所有分离出鲍曼不动杆菌的病例,对替加环素保持敏感的占45.13%。除去未对头孢哌酮舒巴坦进行敏感性检测的病例,分离出鲍曼不动杆菌的病例,对头孢哌酮舒巴坦耐药的比率,2014年为38.96%,2015年为63.06%,p值<0.05,结果有统计学差异。分离出鲍曼不动杆菌的病例,对亚胺培南耐药的比率,2014年为85.82%,2015年为83.83%。所有基础状况中,出现鲍曼不动杆菌感染之前应用广谱抗生素治疗的比率最高为76.25%；其次为合并其他细菌或真菌感染的患者,占所有患者的比率为57.6%；所有患者中有人工气道的占54.51%,其中气管插管患者占21.61%,气管切开患者占32.9%;前述三种基础情况,在所有感染鲍曼不动杆菌的患者中占到半数以上。近期有外伤或者手术史的患者占所有患者的45.49%；所有患者中有冠心病的占36.34%,有糖尿病的占18.41%,有慢性阻塞性肺病的占11.05%。患者的转归情况,其中治愈的患者为8.67%,多为新生儿：好转的患者所占比率最高为63.66%,粗死亡率为13.06%,余14.61%为自动出院。高度耐药组与非高度耐药组相比,14个项目中,两组之间差异有统计学意义的有8项,包括：年龄、COPD、CAD、气管切开、人工气道、前期抗生素治疗、住院天数以及病死率；两组之间差异无统计学意义的有6项,包括：男性、女性、DM、气管插管、外伤或手术、合并其他细菌或真菌感染。[结论]1.鲍曼不动杆菌感染患者以男性居多,老年人为主。偶有小规模暴发,可呈现一定高峰期。2.鲍曼不动杆菌感染患者临床分布广,涉及40个临床科室,其中ICU患者最多。HAP最常见。3.鲍曼不动杆菌对替加环素、头孢哌酮舒巴坦、亚胺培南三种临床常用抗菌药物耐药形势严峻。4.年龄大、患有COPD或CAD、前期应用抗生素、气管切开增加感染高度耐药鲍曼不动杆菌的风险。5.感染高度耐药鲍曼不动杆菌会延长患者住院时间,增加病死率。第二章：泛耐药鲍曼不动杆菌抗菌药物选择的体外研究[研究背景]根据耐药能力的不同,可把细菌分为多重耐药,泛耐药以及全耐药。多重耐药是指细菌对三种以上的抗菌药物类型内的至少一种抗菌药物不敏感；泛耐药是指细菌仅对一种或两种类型的抗菌药物保留敏感性,而对其他被检测的药物类型内的至少一种药物不敏感；全耐药是指细菌对被检测到的全部药物均不敏感。对多种抗生素产生耐药的细菌的出现及播散是医学界一大隐忧,而由多重耐药菌诱发的感染临床控制困难。这一现象在医院获得性感染中尤为明显。接受手术,器官移植,高效免疫抑制治疗,以及患有血液病及获得性免疫缺陷综合征的患者非常容易成为医院获得性感染的受害者。合并感染会延长患者住院时间,增加住院费用,加重药物毒副作用并且增加病死率,同时也给国民经济带来沉重负担。在所有已知报道的多重耐药甚至全耐药细菌中,不发酵乳糖的革兰氏阴性杆菌如鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞杆菌占据重要的一席之地。得益于其固有的附加耐药机制,这种类型的细菌具有快速获得耐药的能力。也就是说,当一种抗生素应用于对抗该类细菌感染后,细菌短时间即可对该抗生素耐药,并且这种耐药能力可在细菌中广泛播散,从而使此种抗生素不能再用于对抗该种细菌感染。这些耐药机制包括：产生p内酰胺酶、超广谱p内酰胺酶或碳青霉素稀酶,核糖体16s亚基甲基化,细胞膜通透性改变,染色体基因突变,外排泵及携带耐药基因的质粒的传递等。近些年,鲍曼不动杆菌尤其泛耐药鲍曼不动杆菌的一线抗菌药物选择局限于多粘菌素、碳青霉烯以及p内酰胺酶抑制剂。随着耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌在世界各地的相继出现,抗感染药物的选择愈加局限,给临床工作带来巨大挑战。因此相关研究人员积极检测临床上已经极少应用于普通细菌感染的老旧药物,并且努力研发新型药物,用以应对这一挑战。此外,某些抗生素联合用药可以产生协同效应,增强抗菌效力,并且减少耐药的发生,减少药物用量从而减轻药物的毒副作用,成为应对耐药菌感染的另一选择。近年来,许多实验室及临床研究显示,抗生素联合用药在对抗耐药细菌感染上具有独特的优势。因此,抗生素联合用药效应的检测也成为对抗泛耐药鲍曼不动杆菌感染的研究热点。本实验检测了临床现有以及即将应用于临床的多种抗菌药物对泛耐药鲍曼不动杆菌的体外抗菌活性,多种抗菌药物两两组合的联合体外抗菌效应,筛选出高效抗菌药物组合,进行时间杀菌曲线检测,为泛耐药鲍曼不动杆菌感染的经验性治疗提供理论基础。此外,本实验固定在两个相邻年份相似的时间段收集细菌,以便分析比较细菌耐药性的变迁。对不同时间段的细菌做药物敏感性评价,以保证临床用药指导的时效性。本研究分为三部分进行。第一部分舒巴坦和替加环素是目前临床常用于抗多重耐药鲍曼不动杆菌感染的药物。多粘菌素因为具有较强的耳肾毒性,在我国现在已经较少应用于临床,而在西方国家,多粘菌素的使用仍然较为广泛。尤其近年来,多粘菌素显示出对耐药的鲍曼不动杆菌较强的抗菌活性,成为国外对抗该菌感染的一线用药。多粘菌素类包括多粘菌素B和多粘菌素E两种,后者又称粘杆菌素。利福平现在基本只用于抗结核杆菌感染,有研究显示利福平对鲍曼不动杆菌也具有良好的抗菌活性,因其作用机制特殊,尚未出现鲍曼不动杆菌对其严重耐药现象。目前尚无研究综合检测前述抗菌药物对泛耐药鲍曼不动杆菌的抗菌效果及联合抗菌效应。本实验首先应用微量肉汤法检测了已知可能对耐药的鲍曼不动杆菌具有抗菌活性的粘杆菌素、利福平、舒巴坦、替加环素四种抗菌药物单独的体外抗菌效应。后应用棋盘法测定四种抗菌药物两两联合的联合抗菌效应,以筛选出高效的对抗泛耐药鲍曼不动杆菌感染的抗菌药物及药物组合,为泛耐药鲍曼不动杆菌感染的临床治疗提供新选择。[研究方法]本实验于2012.11至2013.06期间收集了来自临床标本的泛耐药鲍曼不动杆菌菌株,对于连续多次培养出泛耐药鲍曼不动杆菌的病人,只取一次培养出的菌株。纸片法重筛：纸片法检测了所收集鲍曼不动杆菌菌株对氨曲南、哌拉西林、替卡西林／克拉维酸、头孢曲松、头孢他定、美罗培南、环丙沙星、左氧氟沙星、庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、磺胺甲嗯唑、四环素的耐药性。最终筛选出符合标准的泛耐药菌株25株,所收集标本中有21株来自痰培养,2株来自血培养,2株来自伤口分泌物培养。用微量肉汤稀释法分别检测了粘杆菌素、利福平、舒巴坦、替加环素四种已知对泛耐药鲍曼不动杆菌可能有效的抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC),并应用棋盘法检测了前述四种抗菌药物两两联合的部分抑菌浓度(FIC),计算出部分抑菌浓度指数(FICI)。统计分析了一种抗生素分别与0.5MIC及0.25MIC另一种抗生素联合时,其MIC的变化规律。[研究结果]2012.11至2013.06期间收集的25株泛耐药鲍曼不动杆菌体外抗菌实验结果：1.单一用药抗菌效应利福平MIC范围0.5-8 ug/mL, MIC50 2ug/mL, MIC90 8ug/mL,敏感率44%;粘杆菌素MIC范围2-16 ug/mL, MIC50 2ug/mL, MIC90 8ug/mL,敏感率88%；舒巴坦MIC范围4-≥128 ug/mL, MIC50 32ug/mL, MIC90 64ug/mL,敏感率16%；替加环素MIC范围1-4 ug/mL, MIC50 2ug/mL, MIC90 2ug/mL,敏感率92%。2.两两联合FICI粘杆菌素/利福平组合：出现部分协同效应的比率为56%,相加效应比率为36%,无关效应比率为8%,无协同及拮抗效应。粘杆菌素/舒巴坦组合：出现部分协同效应的比率为32%,相加效应比率为24%,无关效应比率为44%,无协同及拮抗效应。粘杆菌素/替加环素组合：出现协同效应比率为4%,部分协同效应的比率为4%,相加效应比率为36%,无关效应比率为56%,无拮抗效应。利福平/舒巴坦组合：出现协同效应比率为4%,部分协同效应的比率为32%,相加效应比率为40%,无关效应比率为24%,无拮抗效应。利福平/替加环素组合：出现协同效应比率为4%,部分协同效应的比率为60%,相加效应比率为16%,无关效应比率为20%,无拮抗效应。舒巴坦/替加环素组合：出现协同效应比率为8%,部分协同效应的比率为56%,相加效应比率为20%,无关效应比率为16%,无拮抗效应。所有六种药物组合里,舒巴坦与替加环素协同作用最强,利福平与替加环素次之,粘杆菌素与利福平再次之,粘杆菌素与替加环素联合抗菌效应最差。所有药物组合均未出现拮抗效应。3.一种抗生素分别与0.5MIC及0.25MIC另一种抗生素联合粘杆菌素：初始平均MIC 4 ug/mL联合0.25MIC利福平时MIC降至0.83 ug/mL,联合0.5 MIC利福平时MIC降至0.45 ug/mL;联合0.25MIC替加环素时MIC降至1.66 ug/mL,联合0.5 MIC替加环素时MIC降至0.26 ug/mL;联合0.25MIC舒巴坦时MIC降至1.74 ug/mL,联合0.5 MIC舒巴坦时MIC降至1.21 ug/mL。利福平：初始平均MIC 3.38 ug/mL联合0.25MIC替加环素时MIC降至0.72 ug/mL,联合0.5 MIC替加环素时MIC降至0.2 ug/mL;联合0.25MIC粘杆菌素时MIC降至0.67 ug/mL,联合0.5 MIC粘杆菌素时MIC降至0.25 ug/mL;联合0.25MIC舒巴坦时MIC降至1.95 ug/mL,联合0.5 MIC舒巴坦时MIC降至1.72ug/mL。舒巴坦：初始平均MIC 36.43 ug/mL联合0.25MIC替加环素时MIC降至22.43 ug/mL,联合0.5 MIC替加环素时MIC降至2.24 ug/mL;联合0.25MIC粘杆菌素时MIC降至24.29 ug/mL,联合0.5 MIC粘杆菌素时MIC降至8.05 ug/mL;联合0.25MIC利福平时MIC降至28.21 ug/mL,联合0.5 MIC利福平时MIC降至25.26 ug/mL替加环素：初始平均MIC 2.15 ug/mL联合0.25MIC利福平时MIC降至0.54 ug/mL,联合0.5 MIC利福平时MIC降至0.42 ug/mL;联合0.25MIC舒巴坦时MIC降至0.7 ug/mL,联合0.5 MIC舒巴坦时MIC降至0.57 ug/mL;联合0.25MIC粘杆菌素时MIC降至0.84 ug/mL,联合0.5 MIC粘杆菌素时MIC降至0.58 ug/mL。[结论]1.粘杆菌素、替加环素具有良好的体外抗菌效果,利福平单药抗菌效果欠理想,而舒巴坦单独应用对泛耐药鲍曼不动杆菌体外抗菌作用最差。2.粘杆菌素、利福平、舒巴坦及替加环素两两联合可产生更有效的抗菌效应。第二部分西他沙星是一种新型喹诺酮类药物,在我国已进入临床实验阶段,尚未应用于临床。已有研究显示,西他沙星对耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌有良好的抗菌效果,目前尚无研究检测西他沙星对泛耐药鲍曼不动杆菌的抗菌活性,也无研究检测西他沙星与其他抗菌药物联合对泛耐药鲍曼不动杆菌的抗菌效应。本研究第二部分,检测了西他沙星对泛耐药鲍曼不动杆菌的体外抗菌活性及其与粘杆菌素、利福平、舒巴坦、替加环素联合的体外抗菌效应。为临床泛耐药鲍曼不动杆菌感染的控制提供更多选择。[研究方法]本实验后又于2013.11至2014.05收集了来自临床标本的泛耐药鲍曼不动杆菌菌株,纸片法重新检测鲍曼不动杆菌菌株对氨曲南、哌拉西林、替卡西林／克拉维酸、头孢曲松、头孢他定、美罗培南、环丙沙星、左氧氟沙星、庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、磺胺甲嗯唑、四环素的耐药性。得到符合标准的泛耐药菌株24株,其中21株来自痰培养,1株来自血培养,1株来自脑脊液培养,1株来自尿培养。微量肉汤稀释法检测了西他沙星及粘杆菌素、利福平、舒巴坦、替加环素的MIC,以及西他沙星与四种抗菌药物联合的FIC及FICI。统计分析了西他沙星分别与0.5MIC及0.25MIC另一种抗生素联合时,其MIC的变化规律；以及与0.5MIC及0.25MIC西他沙星联合时,四种抗菌药物MIC的变化规律。[研究结果]2013.11至2014.05期间收集的24株泛耐药鲍曼不动杆菌体外抗菌实验结果：1.单一用药抗菌效应西他沙星MIC范围0.125-16 ug/mL, MIC50 1ug/mL, MIC90 2ug/mL,敏感率91.67%；利福平MIC范围1-32 ug/mL, MIC50 4ug/mL, MIC90 16ug/mL,敏感率41.67%;粘杆菌素MIC范围0.5-64 ug/mL, MIC50 2ug/mL, MIC90 8ug/mL,敏感率62.5%;舒巴坦MIC范围4-≥128 ug/mL, MIC50 32ug/mL, MIC90 64ug/mL,敏感率16.67%;替加环素MIC范围0.5-4 ug/mL, MIC50 2ug/mL, MIC90 4ug/mL,敏感率54.17%。2.与第一部分结果相比,替加环素的敏感率由92%下降至54.17%；粘杆菌素的敏感率由88%下降至62.5%;利福平的敏感率由44%下降至41.67%；舒巴坦的敏感率基本无变化。近一年来,泛耐药鲍曼不动杆菌对替加环素的敏感性明显下降,下降比率有统计学意义。3.西他沙星与四种抗菌药物两两联合FICI舒巴坦/西他沙星组合：出现协同效应比率为12.5%,部分协同效应的比率为41.67%,相加效应比率为25%,无关效应比率为20.83%,无拮抗效应。利福平/西他沙星组合：出现协同效应比率为12.5%,部分协同效应的比率为25%,相加效应比率为29.17%,无关效应比率为33.33%,无拮抗效应。粘杆菌素/西他沙星组合：出现协同效应比率为12.5%,部分协同效应的比率为16.67%,相加效应比率为20.83%,无关效应比率为50%,无拮抗效应。替加环素/西他沙星组合：出现部分协同效应的比率为29.17%,相加效应比率为41.67%,无关效应比率为29.17%,无协同及拮抗效应。上述四种药物组合,西他沙星与舒巴坦的协同及部分协同效应最强,与利福平、替加环素的协同效应次之,与粘杆菌素联合无关效应比率最高。均无拮抗效应。4.西他沙星与0.5MIC及0.25MIC的另一种抗生素联合西他沙星：初始平均MIC 1.86 ug/mL联合0.25MIC舒巴坦时MIC降至1 ug/mL,联合0.5 MIC舒巴坦时MIC降至0.76 ug/mL;联合0.25MIC利福平时MIC降至1.37 ug/mL,联合0.5 MIC利福平时MIC降至0.78 ug/mL;联合0.25MIC粘杆菌素时MIC降至1.05 ug/mL,联合0.5 MIC粘杆菌素时MIC降至1.04 ug/mL;联合0.25MIC替加环素时MIC降至1.82 ug/mL,联合0.5 MIC替加环素时MIC降至1.15 ug/mL。4.四种抗菌药物与0.5MIC及0.25MIC西他沙星联合舒巴坦：初始平均MIC 29.54 ug/mL联合0.25MIC西他沙星时MIC降至22.25 ug/mL,联合0.5 MIC西他沙星时MIC降至12.79 ug/mL.利福平：初始平均MIC5 ug/mL联合0.25MIC西他沙星时MIC降至3.82 ug/mL,联合0.5 MIC西他沙星时MIC降至3.31 ug/mL。粘杆菌素：初始平均MIC 5.44 ug/mL联合0.25MIC西他沙星时MIC降至4.16 ug/mL,联合0.5 MIC西他沙星时MIC降至2.05 ug/mL。替加环素：初始平均MIC 2.71 ug/mL联合0.25MIC西他沙星时MIC降至2.2 ug/mL,联合0.5 MIC西他沙星时MIC降至1.73 ug/mL。[结论]1.西他沙星对泛耐药鲍曼不动杆菌具有良好的抗菌效果。2.泛耐药鲍曼不动杆菌菌株对粘杆菌素、利福平、替加环素的耐药能力均增强,其中尤以替加环素最为明显。3.西他沙星与舒巴坦、粘杆菌素、利福平、替加环素两两联合时有较好的联合抗菌效应。第三部分第二部分实验结果显示,四种药物组合里,西他沙星与舒巴坦的联合体外抗菌效应最佳,为进一步明确这两种抗菌药物的体外杀菌效果,我们对2014年11月至2015年12月收集的50株临床分离的XDR鲍曼不动杆菌进行了体外杀菌实验,并描绘相关时间-杀菌曲线。[研究方法]XDR鲍曼不动杆菌菌株的分离及保存方法同前,不予赘述。舒巴坦及西他沙星对50株XDR鲍曼不动杆菌临床分离株的MIC及两种抗菌药物联合的FIC及FICI的检测,方法同前,同样不予赘述。时间-杀菌曲线：按耐药性的不同,可以把所分离的菌株分为4组：对舒巴坦和西他沙星均敏感记为SS,对舒巴坦耐药、对西他沙星敏感记为NS,对舒巴坦敏感、对西他沙星耐药记为SN,对舒巴坦及西他沙星均耐药记为NN。从前述四组中分别选取一株作为代表菌株,进行时间-杀菌曲线检测。细菌培养及菌液稀释同前,于稀释毕的菌液中分别加入0.5MIC或1.0MIC的单药或药物组合。放入35℃C恒温箱中孵育,于Oh, 1h,2h,4h,6h,12h,24h,七个时间点取培养液倍比稀释,计数菌落,计算培养液中的细菌浓度,取其对数值作为纵坐标,时间为横坐标,绘制时间-杀菌曲线。重复两次实验,以确保结果准确可靠。结果判读：抗菌药物组合在24h时,杀灭99.9%的细菌,认为药物组合具有杀菌效应；24h时,药物组合的菌落计数,低于组合内杀菌活性最强的那一抗菌药物菌落数2 log10 CFU/ml,认为两种药物具有协同效应;24h时,药物组合的菌落计数,高于组合内抗菌效果最强的抗菌药物的菌落数21og10CFU/ml,认为两种药物具有拮抗效应；24h时,药物组合的菌落计数,比组合内抗菌活性最强的抗菌药物的菌落计数增高或减低<2 log10 CFU/ml,认为两种药物具有无关效应。[研究结果]药物浓度为1.0MIC时,西他沙星对所有四株菌株均表现出快速杀菌作用。西他沙星-舒巴坦药物组合,在浓度为0.5MIC时,体外用药24h,对菌株SS和NS表现出杀菌作用,对除菌株NN以外的三株菌株均表现出协同杀菌效应。西他沙星-舒巴坦药物组合,在浓度为1.0MIC时,体外用药24h,对所有四株菌株均表现出杀菌作用及协同杀菌效应。此外,西他沙星-舒巴坦药物组合,在浓度为1.0MIC时,对菌株SS及NS完全杀灭,用药24h后,无细菌再生长。[结论]1.西他沙星对XDR鲍曼不动杆菌具有快速体外杀菌作用。2.西他沙星与舒巴坦体外联合具有协同杀菌效应。3.西他沙星-舒巴坦组合的体外协同杀菌效应随药物浓度的提高而增强。