研究背景：骨肉瘤是人类在15-20岁这一时期内多发的常见恶性肿瘤。骨肉瘤患者在20世纪70年代之前主要通过手术进行治疗,但是在行手术切除肿瘤之后患者的生存率不足20%。目前我国作为世界第一人口大国,因骨肿瘤致死或造成残疾、功能障碍人数也逐年增多,位居世界各国之首。关于骨肿瘤的手术治疗,其主要问题不仅在于手术切除后常常残存部分未完全切除的肿瘤组织,这是一个复发的极大隐患,而且还有一个很大的弊端就是在手术切除肿瘤病灶的同时切除了病灶处的负重骨骼；某些发生在特定部位的肿瘤,特别是脊柱肿瘤,因为其发生部位的特殊造成了其常常难以切除,此外,肿瘤组织的跳跃转移以及在手术中这些组织与正常组织结构的接触带来的医源性播散,这些都有可能引起手术后肿瘤的局部复发。因此,在骨肿瘤切除术后往往需要进行化疗,在临床上目前使用最广泛的传统的化疗药物比如阿霉素、顺铂、长春碱类这些药物不仅具有抗肿瘤活性,也因为它们起效的非选择性对人体内的各个组织和器官带来了相应的毒副作用,常规治疗剂量即可对人体产生明显的骨髓移植、心脏毒性、胃肠道反应等毒副作用,这些毒副作用降低了患者的治疗的依从性和生活质量,容易引起患者对治疗的抗拒,通常化疗药物具有时间和剂量的依赖,高药物浓度,较长的半衰期常常可以带来更好的抗肿瘤效果,但是剂量的提高和用药时间的延长通常会带来更加严重甚至致命的毒副作用。在漫长的临床实践中人们渴望获得一种可以提高局部药物浓度,延长药物作用时间的新的化疗药物来减少化疗相关毒副作用,提高化疗效率。随着制药技术的进步,局部缓释药物的概念被提出,其思路是缓释药物,延长药物作用时间并且局部靶向给药,提高药物的选择性；而随着骨组织工程技术的发展,将局部缓释药物与仿生的人工骨材料相结合制备成为在局部植入后可以靶向选择性给药并且能够修复手术造成的负重骨骼缺损,这种思路为骨肿瘤患者的康复带来了新的希望。药物局部缓释系统在肿瘤的治疗方面具有良好的应用前景,这种系统是将一系列具有良好生物相容性、可降解性的无机或有机材料与一种或者是几种传统的化疗药物相结合,通过不同的给药途径植入肿瘤切除术后的原病灶处或者是病灶周围的组织内,由此达到类似于靶向给药的目的。药物局部缓释给药系统对于局部的残存的肿瘤细胞、病灶可以作用较长的时间,药物不需要通过生物代谢,肿瘤细胞在一个较长的时间内暴露在较高浓度的化疗药物下,显著提高了化疗药物的治疗效率,同时相对于传统给药途径来说其避免了长时间的全身给药诱发的各种毒副反应。晚期癌症患者或是不能耐受传统化疗的患者,药物缓释系统植入可以增大给药剂量,局部释放的药物可对肿瘤长时间的直接起效,这对提高晚期患者的生活质量以及延长寿命也有一定的帮助。但是目前的传统的药缓释系统存在着许多的不足之处：1.缓释系统生物相容性差,植入后产生明显的异物排斥反应；2.缓释系统的载药率、封包率低,复合困难；3.复合的药物剂量偏低,持续释放时间不理想；4.复合后容易分解,稳定性差。随着21世纪纳米技术的兴起,极大地推动各个交叉学科的进步,纳米技术的引入为局部药物缓释系统安全性和有效性的提高起到了明显的推动作用。纳米颗粒(nano-particle)有着独特的表征和理化性质,小的尺寸、体积使这类微粒更容易穿透细胞屏障进入组织间隙,显著的提高了被细胞吞噬的能力,此外纳米颗粒还可以增加药物的稳定性和可溶性,同时在改善肾脏的清除率方面可以起到重要作用。在肿瘤组织中的迟滞效应(EPR效应)的基础上,纳米药物可以选择性、特异性的通过配体诱导的细胞表面的胞吞作用增加药物的摄入,在进一步提高疗效的同时减少肿瘤的耐药,通过减少对非目标部位细胞组织器官的损伤,来降低毒性。此外因为纳米材料有其独特的小尺寸、表面或界面效应,纳米级别的羟基磷灰石这类材料可以有效地诱导骨组织再生和细胞生长,因此在骨传导性能上其与传统的毫米、微米材料相比较具有明显优势。局部药物缓释理念,随着骨支架修复材料、抗肿瘤药物的发展,在纳米医学的新生土壤之上,有望继续发挥优势,开发出性能更佳的抗肿瘤纳米缓释包囊和支架材料。我们课题组构建了载ADM-PLGA微球的纳米羟基磷灰石胶原多孔支架(ADM-PLGA-NHAC),并对其表征和骨修复能力及抗肿瘤活性进行了相关检测。研究目的：通过制备搭载了阿霉素(ADM)、聚乳酸-羟弪基乙酸共聚物(PLGA)纳米缓释微球的纳米羟基磷灰石/胶原多孔支架(ADM-PLGA-NHAC),并进行相关实验检测这种材料的理化性质、释药特点以及验证其体内、体外的抗肿瘤能力和骨修复能力,为本材料的临床实验打下坚实基础,为临床骨肉瘤的治疗提供新的思路。研究方法：1.复乳-溶剂挥发法加工阿霉素(ADM)-聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)缓释微球；纳米羟基磷灰石/胶原多孔支架(NHAC)通过冷冻干燥法以纳米羟基磷灰石及胶原为原料进行制备,在NHAC的制备过程中加入ADM-PLGA微球制得载ADM-PLGA纳米微球的纳米羟基磷灰石／胶原多孔支架(ADM-PLGA-NHAC).制备完成后材料在体外通过透析袋扩散法及制备浸提液进行材料的药物释放动力学实验和抗肿瘤实验,再通过扫描电镜(SEM)、激光粒径仪等对微球和支架的表征进行相关测试。2.新西兰大白兔的临界骨缺损模型选择来作为本实验的动物模型,造模完成后的动物随机分为3组：A组骨缺损不予处理作为空白对照组；B组骨缺损处以NHAC填塞；C组骨缺损处植入载ADM-PLGA-NHAC。在手术完成后的第8周及12周处死动物,并对股骨标本行X线检查,所得X线结果根据Lane-Sandhu标准对骨缺损的愈合情况进行评价；X线检查完成后对各组的骨标本进行Micro-CT扫描,扫描图像导入电脑进行3维重建,之后再将扫描数据导入Micro-CT自带的分析软件进行BMD值分析,对骨缺损修复情况进行定量的分析；骨标本行组织学检测(HE、MASSON染色)及扫描电镜(SEM)检测根据结果判断标本的骨修复情况及材料降解情况。3.将MG63细胞接种于裸鼠皮下,成瘤后裸鼠皮下肿瘤以尖刀片随机植入材料,实验终止时处死全部裸鼠,肿瘤剥离、称重并测量肿瘤长、宽计算肿瘤体积。并将肿瘤重量、肿瘤体积进行比较；将裸鼠皮下肿瘤按照标准程序制作石蜡切片(厚度4umm),行HE染色观察肿瘤转移、坏死以及心脏毒性,进行肿瘤组织TUNEL检测并计算坏死率。4.所有的统计分析均由SPSS 13.0软件完成。具体数据均用均值±标准差(X±SD)表示,多组间资料采用单因素方差分析(One-way ANOVA),组间比较采用LSD法(least significant difference),若方差不齐则采用Dunnett’s T3法进行检验；P值<0.05认为差异有统计学意义。研究结果：1.本课题组由乳化挥发法制得的ADM-PLGA纳米微球呈圆球形,平均粒径约为319.5nm±11.17nm,其载药率为(6.42+0.28)%。制备的ADM-PLGA-NHAC复合支架,其孔径经测试约为100-200um,孔隙率可达到约(82.3±4.6)%,材料多孔而且空洞的内壁十分粗糙,有利于细胞黏附及营养交换。释药曲线显示药物并未出现明显的突释现象,24h内药物释放率约为17.6%,本材料在28d内能持续缓慢释放ADM,且释放浓度比较稳定。通过活-死染色及CCK8法检测材料的抗肿瘤效果,结果显示ADM-PLGA-NHAC材料的浸提液在体外随着浓度和时间的增长可以明显抑制MG63细胞的生长。2.建立新西兰兔股骨髁骨缺损模型后植入材料,在手术后的第8周及12周取材进行X线摄片分析、Micro-CT扫描3维重建并进行BMD值分析,结果显示：空白对照组骨缺损未愈合而载药的ADM-PLGA-NHAC支架组与未载药物的NHAC支架组骨愈合程度无明显差异。在石蜡切片组织学检测中显示A组(空白对照组)未见明显新骨形成；B组(NHAC组)可见尚未降解的填充材料与散在其间的大量不规则的新骨组织,新生骨组织开始融合；C组(ADM-PLGA-NHAC组)材料降解程度与B组接近,但不规则的新骨组织数量及新生骨组织融合程度差于B组。12周末时A组在骨缺损边缘处可见少量不规则新生骨组织,而B组、C组均可见较多的成熟骨组织和骨类似组织融合成片且大量的新生骨质与胶原广泛融合且呈片状,局部仍可见少量尚未降解的填充材料,两组均未见明显炎性细胞浸润及组织坏死。3.裸鼠处死后以肉眼观察肺组织有无转移瘤,对剥离干净的肿瘤进行称重、测量体积,分别进行HE染色及TUNEL检测,结果显示ADM-PLGA-NHAC组的抑瘤效果最好,各组均肺部无转移,而在腹腔注射阿霉素组裸鼠出现心脏毒性,而其他各组心脏未见明显异常。研究结论：1.我们课题组将纳米级别的化疗药物缓释囊与纳米级别的羟基磷灰石相结合,通过乳化挥发法、冷冻干燥法研制出了载ADM-PLGA纳米囊的纳米羟基磷灰石/胶原多孔支架并在体外通过一系列理化检测证明了其具有良好粒径、孔隙率、载药率、缓释性能及抗肿瘤能力；2.通过建立新西兰兔股骨髁骨缺损模型并植入我们制备的ADM-PLGA-NHAC材料,在8周后及12周后分别进行X线、Micro-CT以及组织学等检测,结果充分证实了载ADM-PLGA纳米囊的纳米羟基磷灰石／胶原多孔支架具有良好的骨缺损修复能力；3.我们建立了裸鼠的异种骨肉瘤模型,皮下肿瘤长至一定程度后我们通过将材料植入肿瘤内部,通过进行瘤重、肿瘤体积的比较以及肿瘤、心脏的组织学相关检测分析证明了我们研制的这种材料在裸鼠体内具有良好的抗肿瘤效果,并且与传统化疗药物相比较能够显著降低其毒副作用。