阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(Obstructive sleep apnea syndrome, OSAS)被认为是高血压的独立危险因素。慢性间歇性低氧(chronic intermittent hypoxia, CIH)是OSAS的核心病理表现。诸多证据表明睡眠呼吸暂停模式的CIH可能是导致血管内皮炎症损伤进而引起血压升高的核心所在。在间歇性低氧(Intermittent hypoxia, IH)与血管内皮损伤、炎症之间的关系中,具体的信号通路尚不明确,而P38 Mitogen Activated Protein Kinase (P38 MAPK)/Nuclear factor kappa light chain enhancer of activated B cells (NF-κB)信号通路的激活可以放大炎症反应和氧化应激水平,因此可能在高血压血管内皮损伤的发生发展中起到关键作用。前期临床研究表明中药复方补肾清肝方(钩藤、杜仲、川芎；2：2：1)能够起到一定的抗炎、抗氧化作用,对合并有OSAS的高血压患者具有内皮保护效应,但其血管保护机制尚不明确。因此,本研究以慢性间歇性低氧为切入点,以P38 MAPK/NF-κB信号通路为研究对象,以中药复方补肾清肝方为干预药物,通过建立人脐静脉内皮细胞IH及小鼠CIH模型,分别从体外、体内不同角度观察CIH是否引发高血压血管内皮的炎症反应及其损伤机制,探讨补肾清肝方的保护效应及其作用原理。本课题研究分为2个部分：文献综述和实验研究1.文献综述：分别从补肾清肝活血治法与高血压靶器官保护、慢性间歇性低氧及其诱导炎症反应与高血压发病机制的研究进展两个方面进行综述2.实验研究：包括2个部分：间歇性低氧模型的建立和补肾清肝方对间歇性低氧模型血管内皮P38 MAPK/NF-κB信号通路的干预效应研究实验研究一间歇性低氧模型的建立第一部分间歇性低氧细胞模型的建立目的：建立人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)的IH模型,探讨IH能否引起血管内皮炎症损伤及其损伤机制。方法：通过低氧气体(1%O2, 4%CO2,96%N2)与正常氧浓度气体循环灌注密闭的细胞低氧舱,形成低氧/复氧循环(低氧时间5min,常氧时间10min),建立HUVECs的IH模型。实验分为11组：正常对照组(CON组)、间歇性低氧(IH)2、4、6、8、10、12、14、16次循环组、IH+P38 MAPK抑制剂组(INH组)以及持续性缺氧组(SH组)。IH 16次循环结束后,进行细胞粘附功能检测、荧光定量PCR技术(Quantitativepolymerase chain reaction, QPCR)检测细胞间粘附因子(Intercellular adhesion molecule 1, ICAM-1)、E选择素(E-selectin)、白介素1 (Interleukin-1, IL-1)、白介素6(Interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子a (Tumor necrosis factor a, TNF-a)含量,细胞免疫荧光及Western-blot (WB)法检测P38 MAPK /NF-κB通路蛋白的表达。结果：IH后MAPK(Mitogen Activated Protein Kinase)家族蛋白中只有p-P38 MAPK特异性表达量升高,且与低氧／复氧循环次数呈正相关(至14个循环后表达量不再升高)。IH组NF-κB通路蛋白p-IκB, NF-κB P65入核量较正常组表达量升高。同时激光共聚焦镜下可见IH组出现明显NF-κB P65核移位表现。INH组NF-κB P65入核量、p-IκB表达量与CON组比较差异不明显(P>0.05)。SH组p-P38 MAPK, NF-κB P65入核量、p-IκB与CON组差异均不显著(P>0.05)。细胞粘附实验结果显示,与CON组比较,IH组HUVECs的粘附能力增强(P<0.05), INH组及SH组无明显变化(P>0.05)。与CON组比较,IH组炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α表达量升高(P<0.05), INH组及SH组各炎症因子与CON组相比无显著差异(P>0.05)。结论：体外环境下,IH通过激活P38 MAPK/NF-κB通路诱发内皮细胞炎症反应。持续性缺氧则并没有引发明显炎症损伤,对P38 MAPK/NF-κB信号通路无明显干预效.应。第二部分慢性间歇性低氧小鼠模型的建立目的：建立小鼠CIH模型,探讨CIH能否引起血管内皮炎症损伤进而影响小鼠血压及其损伤机制。方法：通过循环灌注N2与02进入密闭的动物低氧舱,形成低氧／复氧循环(低氧时间90s、02浓度10%,常氧时间90s、02浓度21%),建立小鼠CIH模型。实验分为3组：正常对照组(CON组)、模型组(MOD组)、CIH+P38 MAPK抑制剂组(INH组)。CIH干预14天后,测量小鼠尾压并取材。QPCR检测炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α、ICAM-1、 E-selectin表达量。Western-blot法检测P38 MAPK/NF-κB通路蛋白p-P38 MAPK, p-IκB的表达。结果：与CON组比较,MOD组收缩压显著升高(P<0.05)。与MOD组比较,INH组收缩压下降(P<0.05)。MOD组炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α表达量显著高于CON组(P<0.05), INH组与CON组比较无显著差异(P>0.05)；与CON组比较,MOD组P38 MAPK/NF-κB通路蛋白p-P38 MAPK、p-IκB显著增加。INH组p-P38 MAPK、p-IκB与CON组比较差异均不显著(P>0.05)。结论：体内环境下,CIH可能通过P38 MAPK/NF-κB信号通路引发血管内皮的炎症损伤,造成模型小鼠血压升高。P38 MAPK抑制剂SB203580可通过抑制P38 MAPK/ NF-κB信号通路抑制CIH后的炎症状态并抑制小鼠血压升高。实验研究二补肾清肝方对间歇性低氧模型血管内皮P38 MAPK/NF-κB信号通路的干预效应研究第一部分补肾清肝方有效组分对人脐静脉内皮细胞间歇性低氧模型P38 MAPK/NF-κB信号通路的干预效应研究目的：体外环境评价中药复方补肾清肝方对IH后血管内皮炎症损伤的保护效应并探讨其作用机制。方法：在HUVECs的IH模型基础上,按1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml加入补肾清肝方有效组分(异钩藤碱、桃叶珊瑚苷、川芎嗪,GDC),进行最佳浓度筛选。最佳用药浓度确定后,实验分为4组：正常对照组(CON组)、间歇性低氧组(IH组)、IH+补肾清肝方有效组分组(GDC组)以及IH+P38 MAPK抑制剂组(INH组)。中药预处理30min后开始造模,造模方法同前。进行细胞粘附功能检测、QPCR检测ICAM-1、E-selectin、IL-1、IL-6、TNF-α含量,细胞免疫荧光及Western-blot法检测P38 MAPK/NF-κB通路蛋白的表达。结果：QPCR结果提示GDC 0.01μg/ml干预后炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α表达量均低于IH组(P<0.05),其余GDC不同浓度各组与IH组比较无明显变化(P>0.05)。细胞粘附实验结果显示,GDC组HUVECs的粘附细胞数明显低于IH组(P<0.05)； 与IH组比较,GDC组p-P38 MAPK、p-IκB表达量减少。同时激光共聚焦镜下可见GDC组NF-κB P65核移位被抑制。结论：补肾清肝方有效组分(0.01μg/ml)可通过抑制P38 MAPK/NF-κB信号通路实现其对CIH血管内皮炎症损伤的保护效应。第二部分补肾清肝方对小鼠慢性间歇性低氧模型P38 MAPK/NF-κB信号通路的干预效应研究目的：体内环境评价中药复方补肾清肝方(杜仲、钩藤、川芎按重量比例2：2：1配置,BSQG)对CIH血管内皮炎症损伤的保护效应并探讨其作用机制。方法：小鼠CIH模型基础上,分别采用BSQG方高中低剂量进行干预。实验分为7组：正常对照组(CON组)、MOD组(模型组)、INH组(P38 MAPK抑制剂组)、AB组(苯磺酸氨氯地平组)以及BSQG-H组(补肾清肝方高剂量组)、BSQG-M组(补肾清肝方中剂量组)、BSQG-L组(补肾清肝方低剂量组)。造模开始同时进行中药灌胃,造模方法同前。14天后测量小鼠尾压并取材。QPCR技术检测ICAM-1、E-selectin、IL-1、 IL-6、TNF-α含量,Western-blot法检测P38 MAPK/NF-κB通路蛋白的表达。结果：MOD组收缩压明显高于CON组(P<0.05)。 BSQG-H组、AB组、INH组收缩压与MOD组比较均下降(P<0.05),AB组降压效果优于BSQG-H组(P<0.05)。QPCR结果显示BSQG-H组IL-1、IL-6、TNF-α表达量低于MOD组(P<0.01)。 BSQG-H组有优于中低剂量组的优势,但无统计学差异(P>0.05)。同时BSQG-H组抑制IL-1、IL-6优于阳性药对照(AB组)(P<0.05)。BSQG-H组p-P38 MAPK, p-IκB与MOD组比较表达量减少(P<0.05)。结论：补肾清肝方可通过抑制P38 MAPK/NF-κB信号通路实现其对CIH血管内皮炎症损伤的保护作用并降低模型小鼠血压,其抗炎作用优于阳性药对照。