谷氨酸棒状杆菌高产谷氨酰胺突变株的选育与发酵条件的优化

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L-谷氨酰胺是一种条件必需性氨基酸,它是一种重要的营养物质也是一个极有发展前途的药物。在临床上主要用于消化道溃疡和脑神经功能疾病的治疗。世界上谷氨酰胺的主要生产国是日本,韩国也有少量生产,均采用发酵法。1977年日本就已开始采用发酵法,到20世纪90年代中期其发酵水平达到60g.L-1,韩国的发酵水平为50g.L-1。国内目前尚无一家企业生产药用谷氨酰胺。所以我们首先以一株谷氨酸高产的谷氨酸棒状杆菌为出发菌株,用亚硝基胍(NTG)选择较低的杀菌率范围对其进行3次诱变,并选用结构类似物磺胺胍(SG)、甲硫氨酸亚砜(MSO)筛选出具有双重抗性标记的谷氨酰胺高产菌株C.glutamicumNSM-25。其谷氨酰胺最高产量为17.90g.L-1,比出发菌株的产量(9.69g.L-1)高出84.8%。突变株具有较好的遗传稳定性。对此突变株的生理生化特征、培养条件了进行研究。采用单次单因子法的非统计优化技术发现使用NH4NO3比NH4Cl更适作为无机氮源。合适的250mL摇瓶培养条件为调节培养温度为30℃,初始pH为7.2,接种量为10%,种龄为12h,装液量为30mL。添加氧载体正十六烷的实验表明其能促进C.glutamicumNSM-25的谷氨酰胺的合成,说明溶氧对谷氨酰胺的合成具有重要意义。利用Plackett-Burman法从葡萄糖、尿素、NH4NO3、MgSO4、MnSO4、FeSO4和ZnSO4的浓度七个因子中筛选出尿素、NH4NO3和ZnSO4的浓度三个因子对产胺的影响较大。采用响应面法对影响产胺的重要因子进行了优化,发现用于优化实验的三个独立变量尿素、NH4NO3和ZnSO4都是在降低浓度的情况有利于谷氨酰胺的生成,其中NH4NO浓度对C.glutamicumNSM-25的产谷氨酰胺水平有显著的影响。
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