目的阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)目前是一种病因复杂的中枢神经系统退行性病,其特点是隐匿起病,病程呈持续进行性发展的智能衰退,记忆障碍是最早出现和最主要的症状。AD患者早期记忆出现缺失,渐进性语言表达不清(找词困难,命名障碍)、对熟悉事物和人的概念逐渐消失、执行能力障碍、视觉在一定空间内的探索能力减退、思维特别是抽象思维能力退化,部分患者表现为喜怒无常、行为异常改变等,给患者和家属带来极大的精神和身体上的痛苦。在全部痴呆人群中,AD患者大概占到50%~60%。关于AD的发病机制,得到广泛认可的主要是β淀粉样蛋白沉积和tau蛋白学说,随着研究进一步深入,人们发现AD的早期发病机制的核心是突触功能紊乱。突触功能紊乱与AD相关突触蛋白有关,其中包括了突触前膜和突触后膜的相关蛋白。突触相关蛋白异常表达可使大脑突触正常功能产生障碍,导致突触可塑性的改变,这与认知功能障碍密切相关,并且影响AD的整个后期发生发展的进程。因此,系统研究突触相关蛋白在AD中的改变,进一步观察突触相关蛋白的变化,以及所导致的行为变化、蛋白表达改变和整体认知功能的改善情况成为我们此研究的重点。AD的发病机制非常复杂,尚未有效的治疗药物,而中医药研发,及其多成分多靶点特点为治疗AD提供了可能。本课题组以APP/PS1双转基因小鼠为模型,采用参枝苓口服液作为干预药物,本方由党参、桂枝、茯苓、远志、石菖蒲等组成,具有益心气通心阳、化痰开窍之功效。观察参枝苓对模型小鼠学习记忆的改善作用,并通过Western-blot和免疫组化等方法对突触相关蛋白进行检测,观察蛋白表达的含量和分布情况,探讨参枝苓对AD模型小鼠认知及突触的保护作用,为后期探讨如何控制AD病理改变和临床症状的研究提供方法和途径。材料与方法1本实验选择雄性3月龄75只APP/PS1双转基因小鼠,随机分成5组,每组15只,分别为模型组(等体积蒸馏水灌胃)、多奈哌齐组(0.92mg/kg,溶于蒸馏水)、参枝苓大、中、小剂量组(50g/kg、25g/kg、12.5g/kg,溶于蒸馏水)。另选同月龄同背景野生型C57小鼠15只为正常组(等体积蒸馏水灌胃)。实施干预,1次/日,连续灌胃3个月。2运用跳台实验,检测参枝苓口服液对3月龄APP/PS1双转基因小鼠连续干预3个月后行为改变的影响,与正常小鼠的学习记忆能力做对比,观察正常组、模型组和各给药组的区别,分析小鼠在用药后认知功能是否发生改变,来判断参枝苓的效果。3免疫组织化学和Western-blot的方法检测小鼠大脑内特定蛋白含量的改变,从分子层面观察参枝苓对3月龄APP/PS1双转基因小鼠连续干预3个月后中枢神经系统突触相关蛋白mGluR5、α-synuclein和α7-nAChRs的分布与表达水平,评价参枝苓对突触可塑性的调节作用。4运用透射电子显微镜,观察参枝苓口服液对3月龄APP/PS1双转基因小鼠连续干预3个月后海马区突触超微结构的影响。结果1参枝苓连续灌胃三个月可以改善APP/PS1双转基因小鼠的记忆保持能力,记忆保持可以通过跳台实验小鼠潜伏期改变反映。在跳台测试中,与正常组比,模型组小鼠错误次数明显增加(P<0.01);与模型组比,多奈哌齐组和参枝苓中剂量组错误次数明显减少(P<0.01)。模型组小鼠比正常组潜伏期时间明显缩短(P<0.01);与模型组比,多奈哌齐组小鼠潜伏期时间增加(P<0.01),参枝苓中剂量组和参枝苓小剂量组小鼠潜伏期时间均增加(P<0.05)。2免疫组织化学染色结果显示,模型组小鼠海马mGluR5的阳性细胞比正常组小鼠明显增多(P<0.01);与模型组小鼠相比,各用药组小鼠海马mGluR5阳性细胞表达均减少(P<0.01)。模型组小鼠海马α7-nAChRs的阳性细胞比正常组小鼠明显减少(P<0.01);与模型组小鼠相比,多奈哌齐组、参枝苓中剂量组和小剂量组小鼠海马α7-nAChRs阳性细胞表达增多(P<0.01)。模型组小鼠海马α-Syn的阳性细胞比正常组小鼠明显增多(P<0.01);与模型组小鼠相比,多奈哌齐组和参枝苓小剂量组小鼠海马α-Syn阳性细胞表达明显减少(P<0.01),参枝苓中剂量组小鼠海马α-Syn阳性细胞表达减少(P<0.05)。3 Western-blot结果显示,模型组比正常组小鼠mGluR5蛋白表达量显著增多(P<0.01);与模型组比,多奈哌齐组mGluR5蛋白表达量显著减少(P<0.01);与模型组比,参枝苓中剂量和参枝苓小剂量mGluR5的蛋白蛋白表达减少(P<0.05)。模型组比正常组α7-nAChRs蛋白表达量显著减少(P<0.01),多奈哌齐组和参枝苓中剂量组α7-nAChRs蛋白表达量增多(P<0.05)。模型组α-Syn蛋白表达与正常组比,蛋白表达量显著增多(P<0.01);与模型组比,多奈哌齐组、参枝苓中剂量组和参枝苓小剂量组的条带蛋白表达量显著减少(P<0.01),参枝苓大剂量提示蛋白表达量减少(P<0.05)。4电镜结果显示,与正常组小鼠海马区突触结构比,模型组小鼠海马区突触结构有异常改变,突触间隙増宽,突触内线粒体肿胀,前后膜结构不清晰,这些现象表明AD模型小鼠存在突触结构改变;与模型组相比,多奈哌齐组、参枝苓大、中、小剂量组小鼠海马CA1区突触结构基本正常。这些结果说明“参枝苓口服液”对APP/PS1双转基因小鼠海马CA1区突触结构有改善作用。结论参枝苓口服液改善APP/PS1双转基因小鼠的记忆保持能力机制可能是通过调节小鼠海马突触中的关键蛋白mGluR5、α7-nAChRs和α-synuclein发挥作用。参枝苓口服液可以降低已增高的mGluR5和α-synuclein,以及升高已减少的α7-nAChRs含量,从而改善AD模型小鼠记忆保持能力。