为向鸡球虫病三价四株活疫苗临床试验提供依据,依照《兽用生物制品质量标准汇编》和农业部第683公告《兽用生物制品试验研究技术指导原则》,以血便记分、死亡率、相对增重率(RWG)、肠道平均病变记分和病变记分减少率(RLS)为指标,进行了检验用混合强毒株攻毒剂量测定、疫苗组方试验、实验室效力测定、实验室安全试验和稳定性试验等基础性研究。结果表明：1.向14日龄SPF鸡攻击混合强毒株。结果表明,使用剂量为：E. acervulina (ASX)20.00＝104个/只、E. maxima (MSX/MSD各15.00x104个/只、E.tenella (TSX) 4.00×104个/只时,死亡率≥40.00%,十二指肠、空肠和盲肠的平均病变记分分别≥3.00、2.00和3.00,符合效力检验标准中对攻毒组的要求。2.采用正交试验设计疫苗组方,于4、14日龄对SPF雏鸡进行一、二次免疫,二免后第14天攻毒。结果表明,随着免疫剂量水平的提高,免疫攻毒组的RWG. RLS和卵囊抑制率增加,肠道平均病变记分降低。E. acervulina(PAsx)、E. maxima(PMSX/PMSD)和E. tenella (PTSX)的一免剂量分别≥400.00、100.00、100.00和1000.00个/只；二免剂量分别≥800.00、200.00、200.00和2000.00个/只时,免疫攻毒组的死亡率≤10.00%、相对增重率≥80%、RLS≥70.00%、卵囊减少率≥75.00%、三个肠段的平均病变记分均≤1.50,符合效力检验标准。因此,最小免疫剂量：E. acervulina (PASX)、E. maxima (PMsx/PMSD)和E. tenella (PTSX)的一免剂量分别为400.00、100.00、100.00和1000.00个/只；二免剂量分别为800.00、200.00、200.00和2000.00个/只。推荐免疫剂量：Eacervulina (PASX)、E. maxima (PMSX/PMSD)和E. tenella (PTSX)的一免剂量分别为600.00、150.00、150.00和1500.00个/只；二免剂量分别为1200.00、300.00、300.00和3000.00 个/只。3.以最小免疫剂量,分别对2-5日龄的SPF雏鸡首免,10d后二免,二免后第14天攻毒。随着首免日龄的增大,免疫攻毒组的RWG和RLS升高,肠道平均病变记分降低。4日龄及以上首免的雏鸡,攻毒后无死亡,三个肠段的平均病变记分均≤1.50,符合效力检验标准。因此推荐4日龄为最小首免日龄。4.对4日龄SPF雏鸡以最小免疫剂量首免,分别间隔7-11d二免,二免后第14天攻毒。随着二免间隔期的延长,免疫攻毒组的RWG和RLS升高,肠道平均病变记分下降。所有免疫雏鸡,攻毒后无死亡,三个肠段的平均病变记分均≤1.50,符合效力检验标准。表明,最小二免间隔可定为7d。5.以最小免疫剂量首免后第10天和第14天分别对SPF雏鸡攻毒,免疫攻毒组的死亡率≥20.00%,盲肠平均病变记分≥2.00,表明一次免疫后雏鸡产生部分免疫力。于4、14日龄对SPF雏鸡分别一、二次免疫,二免后第6、10、14、28、42和56天攻毒。免疫效力在二免后第14天到达最高峰,之后随着免疫持续期的延长逐渐降低；但是各免疫攻毒组的死亡率均≤10.00%,三个肠段的平均病变记分均≤1.50,符合效力检验标准。表明免疫产生期为二免后的第6天,免疫持续期可至二免后第56天。6.以推荐免疫剂量,分别于4和14目龄对网上和地面平养的雏鸡一、二次免疫,二免后第14天攻毒。免疫攻毒组鸡只无死亡,三个肠段的平均病变记分均≤1.50,符合效力检验标准；免疫期间(二次免疫后14d),网上平养和地面平养的平均增重差异不显著(P≥0.05)。表明网上平养和地面平养对免疫效力和鸡群的增重无明显影响。7.分别以一次单剂量、单剂量重复和一次超剂量(20倍)接种雏鸡,接种组死亡率为0.00%,三个肠段的平均病变记分均≤1.00；对免疫雏鸡进行增重检测,免疫组与空白组相比,平均增重无显著差异(P≥0.05),说明该疫苗的安全性符合兽用生物制品的要求。8.在保存期内(10个月),该疫苗的性状无变化。分别于不同的保存期(2、3、6和10个月)对4和14日龄雏鸡一、二次免疫,二免后第14天攻毒。随着保存时间的延长,免疫雏鸡的RWG和RLS降低,肠道平均病变记分升高；但是各免疫攻毒组死亡率均为0.00%,三个肠段的平均病变记分均≤1.50,符合效力检验标准。结果表明在避光、2～8℃的2.5%的重铬酸钾溶液中,该疫苗的保存期为可达10个月。