口腔颌面部的畸形严重影响患者的身心健康和家庭幸福,功能矫治成为重要的治疗手段。面颌部肌肉组织的适应性变化在牙颌面畸形的矫治中扮演着重要角色。探讨矫形力对肌肉细胞的增殖、分化、凋亡的具体影响和分子机制,对进一步认识矫形治疗的分子机制以及合理利用矫形力提高临床预后具有重要意义。既往研究表明,应力条件下ROS生成显著增加,而JNK、NFkappaB也具有不同程度的活化,提示它们之间可能存在一定的联系。而它们之间如何交互对话以及如何影响细胞的命运尚不清楚。本研究旨在阐明机械牵张力条件下,ROS是调节JNK和NFkappaB这两条信号通路间的交互作用的分子机制及其对细胞功能的具体影响。【目的】本研究旨在探索不同应力条件下ROS的动态变化,他们如何影响成肌细胞的增殖、分化和凋亡,NFkappaB和JNK在该过程中的作用;从而获得应力调控细胞凋亡的相关信息,为正畸治疗中合理使用应力引起肌肉改建提供相应的理论依据。【方法与结果】(1)不同幅度的周期性应力对成肌细胞增殖、分化、凋亡的影响不同。本课题首先通过MTT和DNA Ladder实验测定在受到不同大小的牵张应力作用下(0%, 5%, 10%, 15%, 20% /10 cycles / min)的C2C12细胞的增殖和凋亡的改变,通过检测细胞分化相关基因的表达改变,分析应力条件下细胞分化状态的改变。结果发现,5%的周期性应力可以促进细胞的增殖,同时抑制分化培养基诱导的细胞分化相关基因myogenin等的表达。当牵张应力大于10%后,可以观察到明显的DNA断裂。除此以外,我们还发现牵张应力大于10%后,细胞内开始出现大量的PARP剪切产物,随应力的增加而增多。当周期性牵张应力超过15% 10cycles/min时,整体存活细胞数明显降低。由此可见,高强度牵拉介导的细胞凋亡,参与整体细胞数的减少,可能不利于组织的重塑和再生。(2)周期性应力对ROS的产生、NFkappaB活性、JNK1活化的影响。我们通过荧光染料检测ROS的生成,荧光报告系统检测NFkappaB的活性以及Western Blot检测磷酸化和总体JNK1的水平;分析不同应力条件下细胞内ROS产生量、JNK和NFkappaB的活化程度以及它们间的相关性。结果发现,随着周期性应力的增加,细胞内ROS生成逐渐增加。随着应力的增大,细胞的凋亡逐渐增加,与此同时,JNK1活性逐渐增高,而JNK1表达水平并没有明显改变。与ROS生成量和JNK1活化逐渐增加不同,应力在10%以下时NFkappaB的活性随着应力的增大而增大,而当应力大于15%时,NFkappaB活性开始下降。为了阐明ROS和JNK活性二者之间的关系,我们提前4小时对细胞使用不同浓度的ROS清除剂NAC,然后对细胞施加20%/10cycles/min的牵张应力24小时。结果发现,ROS的产生被NAC抑制。当NAC的浓度达到100μM时,ROS降至基线水平。10μM NAC开始抑制JNK的活性,随着NAC的浓度的增加,JNK活性逐渐降低。10μM NAC处理后增加NFkappaB的活性。NAC浓度的继续增加,NFkappaB的活性先升高后降低,当NAC升高至1000μM时,NFkappaB的活性降至基线以下水平。所有这些结果提示,当ROS的量积累到一定的时候,JNK开始激活,而ROS的量较低的时候,NFkappaB被激活。(3)低强度应力条件下NFkappaB的活化,促进miR146a的表达,后者抑制细胞分化。鉴于低强度条件下,NFkappaB活化,细胞增殖增加而分化受阻。我们分析了该条件下,NFkappaB的重要下游靶分子miR146a的表达及其在过程中的作用。采用miRNA特异性qRT-PCR我们发现,低强度应力条件下,miR146a表达增加,过表达miR146a可以抑制细胞的分化,抑制miR146a的功能可以促进细胞的分化。借助生物信息学发现,分化重要的调节基因Numb是miR146a的靶分子,而过表达miR146a可以观察到Numb的表达降低。Numb的3’UTR报告系统,显示miR146a可以抑制Numb的3’UTR的活性。(4)高强度应力条件下,ROS大量产生,JNK1的激活抑制NFkappaB的活化。在较强的应力作用下,NFkappaB和JNK的活性变化呈现相反的关系,提示JNK的活性可能引起了NFkappaB活性的降低。因此,我们使用JNK的抑制剂预先处理细胞或者JNK的特异性RNAi 24小时后施加20%的周期性的牵张力24小时。结果发现,与对照组相比,抑制JNK信号会增加NFkappaB的活性,进而增强细胞的存活。为了明确NFkappaB活性的抑制是否对JNK激活引起的细胞凋亡起关键作用,我们在JNK被抑制的情况下进一步利用NFkappaB的阻断剂aspirin。结果发现,与单纯使用JNK抑制剂组相比,联合使用JNK和NFkappaB的抑制剂显著降低高强度应力条件下细胞活力,说明在高强度应力条件下,JNK活化通过抑制NFkappaB引起细胞凋亡。(5)高强度应力条件下,JNK的激活阻断了NFkappaB的核转位和Bcl2的转录。为研究JNK1抑制NFkappaB的活化的详细机制和下游效应,我们进一步通过分离胞浆胞核,分析NFkappaB的核定位及RT-PCR分析其下游促进细胞存活分子的表达。结果发现,20%牵张应力条件下,细胞核内几乎检测不到的p65定位。不仅如此,20%的牵张应力条件下NFkappaB的下游抗凋亡靶基因Bcl2几乎不表达;阻断JNK的活性引起细胞核中的NFkappaB水平升高,Bcl2的表达也得以恢复。不仅如此,我们还观察到,JNK抑制剂的功能强于JNK1 siRNA,提示该过程中JNK的其他亚型也可能参与其中。【结论】低强度的应力,促进细胞的增殖、抑制细胞的分化;而高强度应力则引起成肌细胞的凋亡。该条件下,ROS的生成引起NFkappaB和JNK活性的动态变化。低强度条件下,NFkappaB活化引起miR146a的表达增加,后者抑制Numb的表达,进而抑制细胞的分化;而高强度应力条件下,JNK活化,抑制NFkappB的活性,引起抗凋亡基因的表达下调,细胞凋亡增加。该研究为合理应用应力,进行矫形治疗提供了重要参考。