葡萄糖二酸(glucaric acid,GA)是一种重要的多功能有机酸,在食品、医药及化工等领域应用广泛。现阶段,葡萄糖二酸的生产仍以化学氧化法生产为主,在高温高压的反应条件,由金属催化剂催化氧化纤维二糖或淀粉等而得,反应条件剧烈,选择性差,同时产生毒性副产物污染环境,种种不利因素使其受到限制,继而限制了 GA的生产和多功能的发挥。随着合成生物学的发展,将工程细胞作为微型工厂,利用人工组装和优化的代谢路径,合成高价值的目标产物成为未来“绿色制造”的有效途径和必然选择。美国麻省理工学院Prather团队在大肠杆菌中构建了葡萄糖二酸合成途径,并通过一系列改进,提高了葡萄糖二酸的产量。在对该微生物合成GA合成路径的研究中,研究人员发现肌醇氧化酶(myo-inositol oxygenase,MIOX)为合成路径的限速酶;而且,由于大肠杆菌耐酸能力的限制,产量无法超过5 g/L,更换宿主为酿酒酵母或其他菌种成为优于大肠杆菌的选择。然而,有效的高通量筛选方法的缺乏业已成为制约工程菌株高产GA研究中的问题之一。近年来,George M.Church团队在大肠杆菌中构建了一系列根据目标产物浓度产生不同荧光强度的生物传感器,其中包括针对GA的基于CdaR蛋白和一个521 bp核酸序列的启动子的生物感应器。但该GA生物感应器的作用机制并不清晰,且其组成元件均来自于大肠杆菌,在其他物种细胞中的使用受到限制。针对以上问题,本课题进行了如下研究:(1)初步确定转录激活因子CdaR蛋白与启动子序列结合区域随GA浓度变化而发生改变,进而影响启动子下游报告基因转录的作用机制。首先通过DNAaseI足迹实验,分别确定了不同GA浓度条件下,CdaR蛋白所结合的DNA区域的序列,证明CdaR蛋白所结合DNA序列受GA的浓度调节而发生变化;然后基于GA浓度与绿色荧光蛋白报告基因(gfp)转录水平的正相关性,确定了启动序列中的关键核酸序列;通过分析一系列氨基酸突变后的转录激活因子CdaR在GFP表达调控中的有效性,预测并验证了 CdaR与核酸序列结合的螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix,HTH)结构。本部分研究初步确定了大肠杆菌GA生物传感器的作用机制,为进一步优化GA生物感应器在大肠杆菌体系中的使用奠定了基础,并使该GA生物感应器向酵母等系统中的转化成为可能。(2)基于GA大肠杆菌生物感应系统,创建了一锅双菌法,并分别验证了该方法在大肠杆菌和酿酒酵母体系中高通量筛选高产GA工程菌株的有效性。所谓的一锅双菌法,是将生物感应系统的两个组成部分代谢产物合成路径和代谢产物传感器分置于两个菌体内。本研究证明,该方法相对于将生物感应系统置于同一菌体内的一锅单菌法有着更高的重复性和灵敏度,且由于GA生物感应器质粒pJKR-H-cdaR仅能在大肠杆菌系统中使用,所以经实验验证过的同样适用于酿酒酵母系统的一锅双菌法也有着比一锅单菌法更广的应用范围。(3)使用一锅双菌法自鼠源MIOX随机突变文库筛选获得3个GA产量明显提高的突变体,确定了 MIOX发生了突变的活性相关氨基酸位点,然后,通过测定各单位点突变的MIOX的体外活性,确定了增大MIOX活性的两氨基酸位点D82Y和S173N,分别提高了体外GA合成能力至原来的4倍和2.5倍,将D82Y和S173N两增强MIOX活性的位点进行组合,经测定GA产量为突变前的4倍。由于MIOX是GA合成途径中的限速步骤,该研究结果为GA产量的进一步提高奠定了基础。(4)以酿酒酵母为宿主,在肌醇氧化酶MIOX和葡萄糖醛酸脱氢酶(uronate dehydrogenase,Udh)组成的GA合成路径的基础上,通过增加1-磷酸肌醇合成酶(myo-inositol-l-phosphate synthase,INO1)和带有不同类型启动子的 NADH氧化酶(NADH oxidase,NOX),构建了一系列含有不同GA合成途经的酿酒酵母工程菌株,并使用一锅双菌法测定各菌株的GA生产能力,确定了产量明显提高的GA合成路径。其中,INO1的引入增加了利用葡萄糖合成肌醇的途径从而增加了合成GA的底物,不同启动子下的NOX的引入缓解了菌体的代谢负担,受NADH诱导型启动子控制表达的NOX对产量的提高更有帮助,两者分别提高了 GA产量约58%和19%。