研究背景和目的：创伤弧菌(Vibrio vulnificus, Vv)是弧菌属第五群细菌,革兰染色阴性,弯曲、杆状、多形性、运动活泼、有荚膜的细菌,主要生长于海水中的鱼类及贝母类等体内,为嗜盐性海生弧菌。可分为3种生物型(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型),其中Ⅰ型是导致人类创伤感染和原发性败血症的主要致病菌,一般通过外伤接触含病菌的海水或生食海鲜两种途径感染。因此创伤弧菌感染是海上创伤医学中的重要问题,也是海产品食品卫生中的重要问题。其感染后可引起人体严重感染、脓毒败血症,其引发的多器官功能障碍综合症是脓毒败血症患者死亡的主要原因,病死率高达50%以上。创伤弧菌脓毒败血症的形成主要是大量的创伤弧菌侵入到血液之中,而血管内皮细胞是阻挡创伤弧菌进入血管的重要屏障。因此,创伤弧菌对血管内皮细胞的损伤作用及机制是创伤弧菌败血症形成机制中的重要问题。为揭示创伤弧菌对血管内皮细胞的损伤作用,阐明创伤弧菌感染时对人血管内皮细胞结构的影响,我们进行了本项研究,为临床创伤弧菌感染的诊治提供一定的理论依据。方法：1.创伤弧菌一般特性观察和对血管内皮细胞的影响：1.1创伤弧菌标准株ATCC27562,购自中国科学院微生物研究所普通微生物保藏管理中心。复苏培养后,行革兰氏染色,光镜观察,划线接种于硫代硫酸盐—枸橼酸盐——胆盐—蔗糖琼脂(thiosulfate-cifrae-bile salt-sucrose, TCBS)平板及普通营养琼脂平板观察其菌落形态,并接种于弧菌属生化鉴定管及生化条培养24h后,机读细菌鉴定结果。1.2人脐静脉血管内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell, HU),由广州军区广州总医院实验科提供,对其进行VIII因子免疫荧光鉴定。我们通过本课题组前期的实验结果,对创伤弧菌对血管内皮细胞的攻击浓度进行了界定,并通过96孔板培养实验以及MTT法对不同浓度的创伤弧菌侵袭过的血管内皮细胞进行增值抑制率的测定；细胞划痕实验测量不同浓度的创伤弧菌对细胞迁移能力的影响；台盼蓝拒染法检测细胞侵袭后即刻及24h细胞存活率；流式细胞仪测定不同浓度Vv对HU细胞凋亡的影响,选择攻击实验Vv的最高的实验终浓度103cfu/ml。通过Hoechest 33342荧光染色观察HU细胞核的变化；平板克隆形成实验检测细胞集落形成能力的变化,以及50个高倍视野下正常细胞与侵袭后细胞核分裂数的变化,观察极限杀伤浓度下细胞生物学行为的变化。对正常组和创伤弧菌攻击组(104cfu/ml)的细胞爬片进行细胞面积(Ac)和周长(Cc)、细胞核的面积(An)、胞浆面积(Acp)、核浆比(Rnp)以及细胞与核的长轴(dmaxc, dmaxn),细胞与核的短轴(dminc dminn),轴比(Rac、Ran),细胞与核的形状因子PE (PEc、PEn),细胞与核的形状因子AR (ARc、ARn),细胞与核的规划形状因子RFF (RFFc、RFFn),形状不规则指数FⅡ(FⅡc、FⅡn)等参数的体视学测量以检验人脐静脉内皮细胞在创伤弧菌攻击下增殖能力和细胞形态的改变。2、创伤弧菌内毒素的提取、鉴定以及对血管内皮细胞的影响2.1取新鲜培养的创伤弧菌,利用酚水法提取细菌内毒素(LPS),并对LPS进行离心纯化,以及根据2005版《中国药典》规定用内毒素测定方法“鲎试剂”对其进行鉴定,并绘制浓度曲线,确定所提取的细菌LPS的浓度。2.2根据预实验选择创伤弧菌内毒素对细胞的半数致死浓度,选择其上下浓度域共4个浓度对人脐静脉内皮细胞进行MTT,平板克隆,划痕实验测定细胞迁移能力的改变,以及流式细胞仪对细胞凋亡率的测定。对正常组和内毒素10000EU/ml攻击组的细胞爬片进行细胞面积(Ac)和周长(Cc)、细胞核的面积(An)、周长(Cn)、细胞的体积(V),以及细胞的体积密度(Vv)、表面积密度(Sv)、数密度(Nv)等参数的体视学测量以检验人脐静脉内皮细胞在创伤弧菌攻击下增殖能力和细胞以及细胞核形态的改变,以判断细菌内毒素对人脐静脉内皮细胞损伤程度。3、创伤弧菌外毒素的鉴定和浓度的测定,以及其对血管内皮细胞的影响3.1本课题组前期已重组大肠杆菌pET-32a-vvhA/E.coliBL21(DE3),行蓝白斑筛选,挑选白色菌斑进行PCR扩增得到创伤弧菌溶细胞毒素(rVVC),对其进行SDS-PAGE电泳验证,采用BCA (bicichoninicacid)法进行蛋白定量,绘制标准曲线,计算蛋白浓度。对SPF级BALB/c小鼠进行腹腔皮下多点注射,50mg/kg,小鼠处死后对其立即解剖,取主要损伤脏器及组织固定、石蜡包埋后按常规方法制片、HE染色,光镜下观察病理变化。3.2根据预实验选择创伤弧菌溶细胞毒素对细胞的半数致死浓度,选择其浓度域上下共4个浓度对人脐静脉内皮细胞进行MTT,平板克隆,划痕实验测定细胞迁移能力,并用流式细胞仪对细胞凋亡率的测定。对正常组和溶细胞毒素3EU／ml攻击组的细胞爬片进行细胞面积(Ac)和周长(Cc)、细胞核的面积(An)、周长(Cn)以及细胞的体积密度(Vv)、表面积密度(Sv)、数密度(Nv)等参数的体视学测量以检验人脐静脉内皮细胞在创伤弧菌溶细胞毒素(rVVC)攻击下增殖能力和细胞形态的改变,以判断细菌溶细胞毒素对人脐静脉内皮细胞损伤程度。结果：创伤弧菌1.1758株在TCBS平板上生长为绿色菌落,有光泽,为典型的粘液菌落；普通营养琼脂平板上生长为黄白色粘液半透明菌落。生化鉴别结果：“创伤弧菌%id(符合率)=98probablitity"。1、创伤弧菌对人脐静脉内皮细胞增殖能力以及细胞形态的影响(1)通过96孔板培养法和MTT法对不同浓度创伤弧菌侵袭过的血管内皮细胞生长曲线以及吸光率的测定,10cfu/ml组、102cfu/ml组、103cfu/ml组、104cfu/ml组细胞24h增殖抑制率分别为：(10.27±7.17)%,(16.13±14.33)%,(26.01±6.45)%,(37.46±5.06)%；48h增殖抑制率分别为：(13.12±8.60)%,(26.63±5.42)%,(34.20±7.92)%,(42.63±3.58)%；72h增殖抑制率分别为：(16.50±5.92)%,(28.93±5.48)%,(38.93±4.94)%,(49.62±20.35)%：96h增殖抑制率分别为：(25.444±8.15)%,(36.41±15.31)%,(45.37±14.51)%,(52.81±10.51)%。(2)台盼蓝拒染法检测对照组和不同浓度创伤弧菌攻击后的4组HU细胞的即刻存活率和24h存活率,即刻存活率分别为100％、100%、99.48%、99.38%、98.55%；24h细胞存活率分别为100%、96.90％、88.48％、76.78%、57.65%。(3)流式细胞仪测定不同浓度Vv对HU细胞凋亡的影响,创伤弧菌攻击组细胞凋亡率明显高于对照组；(4) Hoechest 33342荧光染色观察HU细胞核,空白对照组血管内皮细胞胞核呈均匀的蓝色荧光,加入创伤弧菌24h后,低浓度组10cfu/ml时开始出现凋亡细胞,到创伤弧菌达到104cfu/ml时凋亡细胞迅速增多,呈圆形或椭圆形的高亮蓝色荧光,可见明显的染色质凝集。(5)平板克隆形成实验中对照组克隆形成率为63.73%,10cfu/ml组为39.60%,比Control组下降37.86%；104cfu/ml组为15.53%,比Control组下降91.17%；比10cfu/ml组下降了60.79%。(6)50个高倍视野下正常细胞核分裂数平均为0.640±0.563,与103cfu/ml组细菌侵袭后细胞核分裂数为4.740±0.751。(7)正常组和104cfu/ml细菌攻击组细胞的形态结构测试结果如下：长轴(μm)分别为：36.17±14.34和30.244±8.21,短轴(μm)分别为：15.644±7.32和22.37±5.73,细胞面积(μm2)分别为：431.26±296.37和537.644±239.285,细胞周长(μm)分别为：82.20±26.10和132.69±30.66,轴比分别为：2.61±1.19和1.39±0.38,PE分别为：0.33±0.11和0.444±0.13,AR分别为：0.90±0.12和0.97±0.05,RFF分别为：0.644±0.12和0.66±0.10,FII分别为：1.80±0.30和1.56±0.28,细胞核面积(μm2)分别为：133.70±26.23和143.07±27.85,胞浆面积(μm2)分别为：312.72±268.04和371.34±237.87,核浆比分别为：0.25±0.10和0.75±0.55。(8)正常组HUVEC细胞大部分呈梭形,胞浆粉染,核圆形或卵圆形,核仁较明显。创伤弧菌104cfu/ml攻击组HUVEC细胞结构模糊不清,胞浆淡染,可见微小空泡结构形成；核染色变浅,核仁碎裂,呈消溶态。2、创伤弧菌内毒素(LPS)的提取、鉴定以及对血管内皮细胞的影响运用酚水法提取的创伤弧菌内毒素(LPS),经高速离心纯化,鲎试剂鉴定,以及酶标仪单波长405nm处测量吸光度,根据比色算出所提取的内毒素浓度为20434EU/ml.(1)用MTT法对不同浓度创伤弧菌内毒素侵袭过的血管内皮细胞吸光率进行测定,得出不同浓度细菌对HU细胞的增殖抑制率2500EU/ml、5000EU/ml、7500EU/ml、10000EU/ml24h的增殖抑制率分别为(1.554±0.409)％、(4.762±0.690)%、(4.028±0.743)%、(47.440±4.716)%；48h的增殖抑制率分别为(1.262±0.494)%、(2.893±1.166)%、(15.498±6.786)%、(59.591±5.696)%；72h的增殖抑制率分别为(1.459±0.458)%、(6.649±0.588)%、(14.074±4.088)%、(48.525±2.159)%；96h的增殖抑制率分别为：(4.248±1.312)%、(8.977±2..089)%、(22.929±3.696)％、(56.342±9.336)％。(2)平板克隆形成实验中对照组克隆形成率为72.73%,10000EU/ml组为40.13%,比Control组下降44.82%。(3)流式细胞仪测定LPS对HU细胞凋亡的影响,LPS攻击组细胞凋亡率明显高于正常对照组。(4)正常组和终浓度10000EU／m的细菌内毒素攻击组细胞的形态结构测试结果如下：细胞核的面积(μm2)分别为：135.80±26.37和150.43±32.69,细胞核周长(μm2)分别为：32.00±6.08和70.67±13.87,细胞面积(μm2)分别为：415.43±72.00和442.26±69.74,细胞周长(μm)分别为：141.06±30.75和133.10±17.55,胞浆面积(μm2)分别为：93.55±20.31和303.50±61.33,核浆比分别为：0.44±0.09和0.65±0.15,体积密度分别为：0.35±0.44和0.30±0.04,数密度分别为：0.00016±0.000042和0.00014±0.000045,表面积密度分别为：39.05±8.21和81.93±16.17。3、创伤弧菌溶细胞毒素的鉴定和浓度的测定及其对血管内皮细胞的影响对本课题组前期所合成的创伤弧菌外毒素进行SDS-PAGE电泳验证融合蛋白rWC,在凝胶上70KD时出现蛋白条带(创伤弧菌溶细胞毒素分子量约为50KD,载体蛋白约为20KD)。根据标准蛋白浓度及其相应的吸光度值,得到标准曲线,根据所测得的稀释样品的吸光度值,计算出相应的蛋白样品的浓度为4000.282ug/ml。选择50mg/kg浓度的VVC对BALB/c小鼠进行腹腔皮下多点注射,24h后用断椎法处死小鼠,取主要损伤脏器及组织固定、石蜡包埋后按常规方法制片、HE染色,光镜下观察小鼠的肺脏出现出血性损伤；肝脏组织局部细胞呈现灶状、片状坏死,有脓肿样改变；其余脏器几无损伤,表明我们所合成的VVC具有明确的生物活性,用其作用于培养的血管内皮细胞,结果表明：(1)用MTT法对不同浓度创伤弧菌溶细胞毒素(VVC)侵袭过的血管内皮细胞生长曲线以及吸光率进行测定(我们将创伤弧菌溶细胞毒素换算成国际单位),2EU/ml、2.5EU/ml、3EU/ml、3.5EU/ml24h的增殖抑制率分别为(3.31±5.61)%、(3.61±8.22)%、(50.31±2.82)%、(55.11±4.52)%；48h的增殖抑制率分别为(3.22±14.21)%、(3.74±7.91)%、(50.7±1.52)%、(58.71±50.71)%；72h的增殖抑制率分别为(6.33±1.91)％、(9.14±10.72)%、(54.23±5.71)%、(55.7±2.13)%；96h的增殖抑制率分别为(4.21±4.23)％、(5.92±11.82)%、(50.11±0.7)%、(54.33±0.9)%。(2)平板克隆形成实验中对照组克隆形成率为67.87％,3EU/ml组为33.47%,比Control组下降52.10%。(3)流式细胞仪测定细菌外毒素对HU细胞凋亡的影响,VVC攻击组细胞凋亡率高于正常对照组。正常对照组、：3EU/ml和3.5EU/ml创伤弧菌溶细胞毒素攻击组正常细胞指数为：97.43％、47.98％、35.07%；凋亡细胞指数分别为：1.77%、51.21%、61.30%。(4)正常组和3EU/ml细菌外毒素(VVC)攻击组细胞的参数值分别为：细胞核的面积(μm2)分别为：135.80±26.37和147.77±40.62,细胞核周长(μm)分别为：32.00±6.08和91.99±18.30,细胞面积(μm2)分别为：415.43±72.00和240.80±77.77,细胞周长(μm)分别为：141.06±30.75和125.83±26.77,胞浆面积(μm2)分别为：93.55±20.31和70.62±30.11,核浆比分别为：0.42±0.08和2.40±3.59,体积密度分别为：0.35±0.04和0.66±0.16,数密度分别为：0.00016±0.000042和0.00029±0.00013,表面积密度分别为：39.05±8.21和214.19±62.76。结论创伤弧菌对体外培养的人脐静脉内皮细胞具有明显的杀伤作用,其杀伤浓度阈值为103cfu/ml。创伤弧菌、创伤弧菌内毒素(LPS)、创伤弧菌溶细胞毒素(VVC)对体外培养的人脐静脉内皮细胞系(HU)的增殖有明显的抑制作用,其抑制能力与创伤弧菌作用的浓度和时间有关,与创伤弧菌内毒素(LPS)、创伤弧菌溶细胞毒素(VVC)作用的浓度有关；均能改变血管内皮细胞的形态并可损伤血管内皮细胞。且通过动物实验可以观察到：溶细胞毒素可以明显损伤小鼠的肝脏和肺脏组织。