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芍药(Paeonia lactiflora Pall.)隶属芍药科芍药属,属多年草本花卉,原产我国,具有很高的观赏价值和经济价值。芍药的生产面临多种来自环境胁迫的影响,温度、水涝及高盐胁迫是影响植株生长发育的重要因素。此外,芍药红斑病也为其生产和观赏带来威胁,该病多发生于高温高湿的条件下,主要危害芍药叶片和茎部,严重时可致整株植株枯萎。因此研究芍药抗逆相关功能基因可以为芍药抗性基因工程育种奠定坚实的基础。本研究在前期克隆获得PlWRKY13和PlWRKY65基因的基础上,通过不同胁迫处理下基因的表达特性和病毒介导的基因沉默技术(virus-induced gene silencing,VIGS)对二者的抗逆相关功能展开初步研究,主要研究结果如下:(1)从患有红斑病的叶片中分离得到一种病原菌,经镜检、测序和ITS序列同源性比对,确定其为红斑病致病菌细极链格孢(Alternaria tenuissima),将该菌ITS序列提交至NCBI,基因登陆号为MN097229。(2)利用荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)分析不同胁迫环境下PlWRKY13和PlWRKY65的表达模式,结果显示PlWRKY13和PlWRKY65的表达均受低温、高温、水涝和盐胁迫的诱导而上调;当植株受到红斑病病原菌细极链格孢侵染后,PlWRKY65正向调控响应病原菌的诱导,而PlWRKY13的表达呈先下降后上升的趋势。(3)利用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术成功获得PlWRKY13和PlWRKY65沉默植株。进一步对PlWRKY13和PlWRKY65在芍药抵御细极链格孢中的作用的研究结果显示:在细极链格孢的诱导下,PlWRKY13和PlWRKY65沉默植株中目标基因的表达趋势与对照一致,但表达水平极显著低于对照植株;且两种沉默植株叶片均对细极链格孢的敏感性增强,表现为二者发病较对照植株严重,病情指数(disease index,DI)极显著高于对照,同时一些病程相关(pathogenesis-related,PR)基因的转录丰度也发生显著变化,暗示PlWRKY13和PlWRKY65在芍药与细极链格孢互作过程中起到正向调控作用。(4)测定正常植株和PlWRKY13、PlWRKY65沉默植株的内源茉莉酸(jasmonic acid,JA)、水杨酸(salicylic acid,SA)和脱落酸(abscisic acid,ABA)含量,结果发现,正常植株受到细极链格孢侵染后96 h内,JA含量整体呈增加趋势,而SA含量变化趋势与JA完全相反,ABA整体含量降低;PlWRKY13沉默株中JA和SA对细极链格孢的响应变化与对照株基本一致,但二者总体含量低于对照株,与对照中大幅度下降不同,ABA含量呈缓慢略微下降趋势;PlWRKY65沉默株中,JA和SA的响应变化同样与对照株基本一致,JA整体含量低于对照植株,而SA整体含量高于对照植株,ABA含量变化在接菌12 h后与对照有相同的趋势且含量高于对照。这说明在受到侵染后,芍药叶片中JA、SA与ABA含量的变化与抗病过程有着密切的联系,且与PlWRKY13和PlWRKY65是否沉默也有着一定的关联,PlWRKY13和PlWRKY65可能参与了这三种激素介导的抗病信号途径。