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研究背景及目的支气管哮喘(Bronchial asthma,asthma)是一种气道慢性炎症性、过敏性疾病,气道重塑(Airway remodeling)是慢性支气管哮喘重要病理学特征,主要表现为气道基底膜增厚和上皮下纤维化、气道平滑肌的肥厚、增殖、细胞外基质蛋白的沉积,炎性细胞浸润和腺体增生肥大等等。而作为气道中数目和体积最大的细胞:气道平滑肌细胞(Airway smooth muscle cell,ASMC),在哮喘气道重塑中发挥重要的作用,被认为是哮喘气道重塑的关键细胞。ASMC的收缩、增殖、肥大、分泌细胞外基质蛋白等促进气道重塑的发生发展,并进一步加重气道高反应性(Airway Hyperreactivity,AHR)。近年来有研究发现,ASMC也具有迁移的功能,这种迁移与动脉粥样硬化时血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell,VSMC)的迁移相类似,因此可以推测:哮喘时ASMC在细胞外基质的影响和各种细胞因子、炎症介质和生长因子的联合作用下,ASMC向气道内膜定向移动并发生增殖,导致气道壁的增厚和狭窄,虽然目前还缺乏ASMC向气道内膜直接迁移的证据,但有研究发现,在哮喘患者气道活检组织标本中,气道固有层内发现的肌纤维母细胞在显微结构、形态学和位置方面都与ASMC极其相似,提示肌纤维母细胞可能是ASMC迁移并转化而来,ASMC的迁移的研究是近来的热点之一,但对于ASMC迁移的机制目前还不十分清楚。目前已经发现,细胞因子和炎症介质包括PDGF、IL-1β、尿激酶、半胱氨酸白三烯、LPA等能够趋化ASMC的迁移,而作为哮喘时气道内一种重要的炎症介质,内皮素-1(Endothelin-1,ET-1)是目前已知的收缩支气管最强烈的物质之一,哮喘时气道上皮损伤后表达增多,已经发现它能诱导许多类型的细胞例如嗜酸性粒细胞(EOS)、血管平滑肌细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、表皮黑素细胞等迁移,但ET-1能否诱导ASMC的趋化迁移,目前还缺乏相关研究。Rho/Rho激酶信号通路是细胞内重要的信号通路,Rho激酶(ROCK)是该通路的关键分子,越来越多的证据表明该通路参与了哮喘时气道高反应性(AHR)的形成、EOS向BALF聚集、气道重塑等多种病理生理过程,但该通路在ASMC迁移中报道甚少。因此,本实验主要对以下两个方面进行研究:一)研究ET-1对ASMC的诱导迁移作用。二)初步探讨Rho激酶信号通路在ASMC迁移中的作用。材料与方法1、经患者同意,取南方医院胸外科同期做肺叶切除术患者的正常肺叶、段支气管标本。2、组织块贴壁法培养人支气管平滑肌细胞(Airway smooth muscle cell,ASMC),光镜下观察和细胞免疫组化进行ASMC鉴定。3、使用改良的boyden chamber小室检测不同浓度ET-1作用下ASMC的跨膜迁移能力的变化,5ng/ml的PDGF作为阳性对照。4、不同浓度的Rho激酶特异抑制剂Y-27632阻断Rho激酶信号通路,观察该信号通路在ET-1诱导的ASMC迁移中的作用。5、FITC标记的鬼笔环肽标记F-肌动蛋白骨架,激光共聚焦扫描显微镜观察ASMC细胞骨架的变化。6、Western blot检测ET-1作用不同时间Rho激酶信号通路下游底物肌球蛋白磷酸酶目标亚单位1(myosin-phosphatase target 1,MYPT1)的磷酸化水平,以反应Rho激酶信号通路的活化状况。7、采用SPSS13.0统计软件进行结果分析,统计数据用均数±标准差((?)±S)表示,组间比较用one-way ANOVA分析,P＜0.05为差异有统计学意义。结果1、ASMC的形态及免疫组化鉴定:倒置显微镜下单个ASMC呈长梭形,贴壁生长至融合后,细胞呈现出特征的“峰谷”状形态。细胞免疫组化平滑肌细胞表型标志物a-actin鉴定,光镜下可见细胞浆中较多棕黄色颗粒为染色阳性细胞。2、ET-1在0.1、1、10、100nmol/L浓度有诱导ASMC跨膜迁移的作用,迁移细胞数目分别为(25.2±1.56)、(36.03±2.94)、(49.80±4.47)、(37.96±3.59)个,ET-1浓度在10nmol/L趋化ASMC跨膜迁移能力最强,与对照组(19.08±2.06)个相比,二者差异有统计学意义(P＜0.01)。5ng/ml的PDGF能显著诱导ASMC迁移(87.73±6.14)个,与对照组(19.08±2.06)相比,差异有统计学意义(P＜0.01)。3、Rho激酶抑制剂Y-27632呈浓度依赖性抑制ET-1(10nmol/L)诱导的ASMC跨膜迁移,且随着其浓度的增加,抑制作用越明显,Y-27632浓度为0.4μmol/L、2μmol/L、10μmol/L时迁移细胞数目分别为(44.26±2.50)、(34.56±1.67)、(20.93±1.84)个,其中Y-27632浓度10μmol/L时显著抑制ASMC的跨膜迁移,与Y27632(0μmol/L)组(48.30±2.64)个相比,差异有统计学意义(P＜0.01)。4、激光共聚焦观察细胞骨架:空白对照组细胞有少量短而细的应力纤维,无丝状伪足形成。ET-1(10nmol/L)刺激30min细胞即发生伸展,应力纤维形成增多;加入Rho激酶特异抑制剂Y-27632(10μmol/L)预处理后,细胞轮廓变细,伪足及应力纤维少见。5、western blot:ET-1(10nmol/L)处理15min、30min、1h、2h、6h、12h、24h后,磷酸化MYPT1(p-MYPT1)蛋白的相对表达量分别为:0.68±0.04、0.66±0.10、0.44±0.06、0.48±0.14、0.43±0.13、0.39±0.10、0.28±0.05。与空白组(0.37±0.03)相比,ET-1处理15min、30min后p-MYPT1表达水平显著增加,差异有统计学意义(P＜0.01);随着时间的延长,p-MYPT1表达程度减弱,与对照组相比,差异无统计学意义(P＞0.05)。结论ET-1能够激活Rho激酶信号通路,且在一定浓度范围内具有诱导ASMC跨膜迁移的能力。Rho激酶信号通路抑制剂Y-27632显著抑制了ET-1诱导的ASMC迁移和细胞骨架的变化,提示Rho激酶信号通路在ET-1诱导的ASMC迁移中发挥重要的作用,这种作用可能通过细胞骨架的改变而介导的。