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背景线粒体心肌病(mitochondrial cardiomyopathy)是由心肌组织线粒体呼吸链相关基因缺陷导致的心肌形态及功能异常的一类疾病。线粒体心肌病涉及的临床表型有多种,包括肥厚型心肌病、扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)、限制型心肌病以及左心室心肌致密化不全等。线粒体呼吸链能量产生过程的关键元件之一是铁硫簇,而ISCA1(Iron-sulfur cluster assembly 1)是铁硫簇的重要组装因子,其对于Fe4S4蛋白的成熟至关重要,体外实验发现Isca1的异常可影响线粒体呼吸链电子传递过程,而且关于Isca1参与的疾病报道主要涉及脑和肌肉。因此,我们推测Isca1对机体另一高耗能器官—心脏同样具有重要作用。本文拟通过建立系统性Isca1敲除大鼠模型(Isca1-/-)、心肌组织特异性Isca1敲除大鼠模型(Isca1flox/flox/MHC-Cre),来研究Isca1对大鼠机体发育及心脏形态与功能的影响,明确Isca1在心脏发育及心衰病理进程中的生物学作用,为心衰等心血管疾病的防治提供理论依据和线索。方法1)CRISPR-Cas9技术构建系统性Isca1敲除大鼠及心肌组织特异性Isca1敲除大鼠大鼠并进行繁育。2)ISCA1在大鼠各组织中的定位与表达:PCR技术检测Isca于RNA水平在野生大鼠各组织中的表达;荧光定位观察ISCA1于系统性Isca1敲除大鼠模型中的表达;免疫荧光技术观察ISCA1于野生大鼠心肌细胞中的定位;Western blot检测ISCA1于心肌病患者及心肌病小鼠模型心肌组织中的蛋白水平。3)PCR技术鉴定系统性Isca1敲除大鼠及心肌组织特异性Isca1敲除大鼠基因型,并进行生存率分析。4)系统性Isca1敲除大鼠胚胎发育分析:制备系统性Isca1敲除大鼠2.5日龄胚胎和8.5日龄胚胎并通过显微拍照进行形态学观察;PCR技术鉴定胚胎基因型。5)心肌组织特异性Isca1敲除大鼠心脏形态及功能分析:6.5日龄敲除大鼠心脏大体解剖及心重/体重比记录;核磁共振影像检测0.5日龄、2.5日龄及6.5日龄敲除大鼠心脏结构和功能;超声影像检测胚胎17.5日龄、胚胎20.5日龄、0.5日龄、2.5日龄及6.5日龄Isca1敲除大鼠心脏结构和功能;H&E染色和透射电镜观察6.5日龄敲除大鼠病理学变化。6)能量代谢相关分析:Western blot技术分析系统性Isca1敲除大鼠8.5日龄胚胎大鼠NDUFA9和AC02蛋白水平。Western blot检测心肌组织特异性Isca1敲除大鼠线粒体呼吸链相关蛋白水平;比色法检测线粒体呼吸链相关酶活性;比色法测定心肌组织ATP含量。结果1.系统性Isca1敲除大鼠的建立、表型观察及机制分析1)使用CRISPR-Cas9技术构建系统性Isca1敲除大鼠模型,并依据测序结果选定所需基因型大鼠。2)在RNA水平上,Isca1在心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、肌肉、脂肪、脑各组织中均有不同程度的表达,并在脾脏、脑、心脏中表达较高,在肝脏中表达较低;蛋白荧光定位观察发现ISCA1于大鼠各组织中广泛表达,并于心脏、肌肉、肝脏、肾脏、睾丸等部位表达较高;3)系统性敲除大鼠繁育过程中,子代无纯合子,系统性Isca1敲除大鼠纯合子胚胎于4细胞期(胚胎2.5日龄)正常发育,但在胚胎8.5日龄时胚胎出现发育异常或发育阻滞;纯合子胚胎的NDUFA9蛋白水平下调,AC02蛋白水平上调,均有显著性差异(P<0.05)。2.心肌组织特异性Isca1敲除大鼠的建立、表型观察及机制分析1)ISCA1在心肌组织特异性Isca1敲除大鼠的心肌组织内敲除效率高于90%;ISCA1主要定位于心肌线粒体内;在心肌病患者及心肌病小鼠模型心肌组织内表达增高。2)心肌组织特异性Isca敲除大鼠子代纯合子于出生后7～10天全部死亡;6.5日龄心肌组织特异性Isca1敲除纯合子大鼠呼吸虚弱,处于濒死状态,大体解剖发现心脏整体增大,心重/体重比增加(P<0.05);核磁共振影像和超声影像分析显示,6.5日龄敲除大鼠心脏整体增大,心腔扩张,心功能下降,出现重度心衰;我们观察了胚胎期17.5及20.5日龄,出生后0.5、2.5及6.5日龄,共5个时间点,我们发现敲除大鼠的病理表型呈渐进性发展的特点,且于胚胎期17.5日龄敲除大鼠与同窝正常对照大鼠相比已无差异。3)6.5日龄时,心肌组织特异性Isca1敲除大鼠心肌组织内线粒体复合物Ⅰ亚基NDUFA9和NDUFS3蛋白、线粒体复合物Ⅱ亚基SDHB蛋白水平显著下调(P<0.01);AC02、线粒体复合物Ⅲ亚基UQCRC2和线粒体复合物Ⅳ亚基COXⅣ蛋白无显著性变化(P>0.05)。线粒体复合物Ⅰ、线粒体复合物Ⅱ、线粒体复合物Ⅳ酶活性均显著降低(P<0.01)。结论ISCA1在大鼠全身各组织内广泛表达,且在心脏及肌肉等高耗能器官表达较高;Isca1全敲除可导致大鼠胚胎发育异常,且出现于胚胎8.5日龄左右,胚胎内线粒体呼吸链关键蛋白NDUFA9水平下调、AC02水平上调,提示线粒体能量代谢异常;心肌组织特异性Isca1敲除可引起大鼠心腔扩张,心功能下降,并于出生后6-8天呈现心衰,直至死亡,心肌组织内线粒体呼吸链复合物相关分子表达及活性异常,提示ISCA1在机体发育,特别是心脏发育进程中发挥重要作用,推测ISCA1在参与的线粒体能量代谢过程发挥了重要作用,该研究为ISCA1生物学功能的明确及心衰等心血管病的防治提供了新的依据和线索。