【摘 要】
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研究目的:青少年骨性Ⅱ类错畸形是正畸临床中的常见疾病,对轻中度的青少年骨性Ⅱ类患者多采用功能矫治器治疗。临床资料发现,患者佩戴功能矫治器前导下颌,有助于髁突的适应性改建,而如果功能矫形力过大,下颌过度前伸,关节会出现不适的症状,严重者甚至会出现颞下颌骨关节炎。有学者的研究表明,内质网应激作为细胞对外界刺激做出的首要反应之一,过大或持续时间过长的刺激可激活下游的凋亡信号分子,其中PERK/CHOP信
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研究目的:青少年骨性Ⅱ类错畸形是正畸临床中的常见疾病,对轻中度的青少年骨性Ⅱ类患者多采用功能矫治器治疗。临床资料发现,患者佩戴功能矫治器前导下颌,有助于髁突的适应性改建,而如果功能矫形力过大,下颌过度前伸,关节会出现不适的症状,严重者甚至会出现颞下颌骨关节炎。有学者的研究表明,内质网应激作为细胞对外界刺激做出的首要反应之一,过大或持续时间过长的刺激可激活下游的凋亡信号分子,其中PERK/CHOP信号通路起关键作用。m6A甲基化是真核生物RNA中最丰富的表观遗传修饰之一,受m6A甲基转移酶和去甲基化酶的共同调控。相对于经典的“中心法则”,遗传信息从DNA经由RNA流向蛋白质的调控,功能矫形力过载的过程中,是否有m6A表观遗传修饰参与尚未见研究报道。本研究从颞下颌关节髁突软骨着手,研究PERK/CHOP信号通路在功能矫形力过载的软骨细胞的表达,并在转录后水平上探究m6A甲基化在功能矫形力过载过程中的变化,为临床上合理利用矫形力,预防TMJ OA的发生提供新的理论依据,开辟新的研究角度。研究方法:1.构建下颌过度前伸的大鼠模型以模拟矫形力过载的体外环境,在构建模型后4周和8周的两个时间点,收集髁突样本采用HE染色、TRAP染色和番红O/固绿（SO）染色评估大鼠实验组与对照组的的颞下颌关节的修复改建以及髁突软骨、软骨下骨的改变。2.构建机械力过载的微环境以模拟功能矫形力过载的细胞环境,研究应力加载对软骨细胞m6A甲基化水平、内质网应激和凋亡的影响。首先,对软骨前体细胞施加过载的机械力,CCK8分别检测加力0、3、12、24小时后软骨前体细胞的增殖活性,通过WB,PCR来检测GRP78、PERK、CHOP等相关因子变化,FITC/PI流式双染和Hoechst33342流式法检测细胞的凋亡变化。同样,用WB,PCR来检测24小时加力组和空白组软骨细胞的m6A甲基化相关因子METTL3、FTO、ALKBH5、METTL14在应力条件下的变化。m6A RNA定量检测试剂盒（荧光法）检测各组总RNA的m6A甲基化水平。结果:1.模型构建后的4周和8周,髁突出现退行性变、骨质吸收。HE染色提示软骨细胞密度降低,界限不清,骨小梁排列紊乱,8周组重于4周组。番红O/固绿染色提示加力组软骨细胞受损,蛋白多糖向外释放丢失,且随时间逐渐加重。TRAP染色发现软骨下骨和骨髓腔中破骨细胞数量明显升高,提示破骨活动增强。2.小鼠软骨细胞加载过大的机械牵张力后,细胞的增殖活性在0～24内随时间增加而逐渐降低。3.体外实验中,荧光定量PCR和WB显示:与对照组比较,加力组软骨细胞GRP78、PERK、CHOP的基因和蛋白的水平上的表达均明显升高,且随时间逐渐表达逐渐升高,提示软骨细胞发生内质网应激和凋亡。4.FITC/PI双染和Hoechst染色结果显示:相比与对照组,实验组软骨细胞在加载过大的机械牵张力后出现凋亡,随着应力加载时间的增加细胞的凋亡也逐渐增加。5.m6A RNA定量检测实验结果显示:加力后的软骨细胞总RNA中m6A甲基化水平降低。6.体外实验中,荧光定量PCR和WB显示:与对照组比较,加力组软骨细胞中的甲基转移酶METTL3、METTL14的表达明显降低,去甲基转移酶FTO和ALKBH5的表达并未出现明显变化。结论:在功能矫形力过载导致TMJ OA的过程中,大鼠髁突出现退行性变、破骨活动增强,骨质破坏、软骨细胞受损。内质网应激介导的凋亡通路PERK/CHOP信号通路的激活在软骨细胞凋亡发挥着重要的作用。此外,我们发现METTL3/14介导m6A甲基化水平在这一过程中的发生了明显的变化。鉴于目前TMJ OA的致病机理和发病性质尚未明确,作为最常见的转录后表观遗传修饰,从该角度探究m6A甲基化在机械牵张力过载致软骨细胞凋亡中的作用机理具有重要意义,并为有效防治TMJ OA提供一个新理论方法。
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