论文部分内容阅读
肠纤维化是炎症性肠病(inflammotory bowel disease, IBD)，尤其是克罗恩病(Crohn’s disease, CD)严重的并发症。目前认为肠纤维化是在易感基因基础上，出现肠黏膜免疫失调与肠菌抗原相互作用，产生炎症细胞浸润，释放的炎症细胞因子和生长因子等激活肠间质细胞产生胶原在肠壁沉积所导致。肠肌成纤维细胞是肠纤维化发生的关键细胞。转化生长因子(transforming growth factor, TGF)-β1是肠肌成纤维细胞分泌的主要促纤维化细胞因子。TGF-β1/Smad3信号通路在肠纤维化进程中起到重要作用。体内外实验均证实发生纤维化的肠组织TGF-β1表达较正常肠组织显著增高，其持续过度表达导致肠道中细胞外间质(extracellular matrix, ECM)的积聚、重塑。在胶原大量合成时TGF-β1抑制ECM降解酶，即基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)和纤溶酶原蛋白酶的活性，通过刺激基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP)的产生而抑制MMP的表达。肿瘤坏死因子样配体1A (tumor necrosis factor ligand-relatedmolecule-1A, TL1A)是IBD的易感基因肿瘤坏死因子超家族成员15(tumornecrosis factor superfamily member15, TNFSF15)的蛋白产物。TL1A主要在内皮细胞表达，近年研究表明其在黏膜固有层T淋巴细胞、单核细胞和DC中也有表达。TL1A可通过与主要表达在活化的T细胞的死亡受体3(death receptor3, DR3)结合，为T淋巴细胞的激活提供协同刺激信号，影响机体免疫调节，参与包括IBD在内的多种炎症性疾病。目前研究显示，TL1A与UC相关肠纤维化有相关性。研究主要集中在TL1A调节肠粘膜炎症与严重程度以及诱导肠纤维化的发生的体内实验，但没有针对TL1A在IBD相关肠纤维化作用的体外细胞实验。为此，本实验在于探索TL1A在体外对TGF-β1介导活化的肠成纤维细胞的胶原代谢的影响及机制。目的：探讨TL1A在体外对肠成纤维细胞的胶原代谢的影响及其机制。方法：TL1A干预的外周血单个核细胞上清干预TGF-β1活化的CCD-18Co，实验分组如下：①Control组，以含0％胎牛血清的MEM细胞培养液培养细胞，在外周血单个核细胞上清干预步骤加入无TL1A上清；②TL1A组，以含0％胎牛血清的MEM细胞培养液培养细胞，在外周血单个核细胞上清干预步骤加入含TL1A上清；③TGF-β1组，以含TGF-β1的0％胎牛血清的MEM细胞培养液培养细胞，在外周血单个核细胞上清干预步骤加入无TL1A上清；④TL1A+TGF-β1组，以含TGF-β1的0％胎牛血清的MEM细胞培养液培养细胞，在外周血单个核细胞上清干预步骤加入含TL1A上清。CCK-8法检测TL1A促进外周血单个核细胞转化的最适浓度；MMT法检测TGF-β1活化CCD-18Co的最适浓度；BrdU法检测CCD-18Co增殖；流式细胞术分析细胞周期变化；采用单克隆抗体α-SMA行免疫细胞化学染色检测活化的CCD-18Co；羟脯氨酸测定盒（消化法）测定CCD-18Co细胞培养液的羟脯氨酸含量；Western Blot及real-time Q-PCR技术分别检测CCD-18Co的α-SMA、Ⅰ型胶原(Collagen type Ⅰ, Col1) α2、Ⅲ型胶原(Collagen type Ⅲ, Col3) α1、MMP-3、TIMP-1、TGF-β1、p-Smad3蛋白以及Col1α2、Col3α1、纤维连结蛋白(fibronectin, FN)、MMP-3、TIMP-1、TGF-β1、Smad3mRNA的表达。结果：①CCK-8法结果显示：30ng/ml TL1A培养72h对外周血单个核细胞活力促进效果最为显著。②MMT法结果显示：20ng/ml TGF-β1培养24h对CCD-18Co活力促进效果最为显著。③BrdU法检测结果显示，同Control组相比，TL1A组、TGF-β1组DNA合成轻度升高，分别升至124.4%、105.2%，P<0.05；TL1A+TGF-β1组则显著促进CCD-18Co DNA合成，增殖率为178.1%，P<0.05。④TL1A使CCD-18Co细胞周期S期细胞比例增加，G0/G1期和G2/M期细胞比例下降。⑤免疫细胞化学染色检测结果显示：TL1A组、TGF-β1组、TL1A+TGF-β1组CCD-18Co的α-SMA蛋白表达水平较Control组增加(11.52±0.20,7.04±0.10,14.94±0.03vs3.49±0.35, P<0.05)。⑥细胞培养液羟脯氨酸含量测定结果显示：同Control组相比，TL1A组、TL1A+TGF-β1组羟脯氨酸含量轻度增加(10.51±0.28,11.15±0.24vs10.22±0.17, P<0.05)，但Control组与TGF-β1组之间无明显差异(10.06±0.18vs10.22±0.17, P>0.05)。⑦Western blot和real-timeQ-PCR检测结果显示：与Control组相比，TL1A组、TGF-β1组、TL1A+TGF-β1组CCD-18Co中α-SMA、Col1α2、Col3α1、MMP-3、TIMP-1蛋白以及Col1α2、Col3α1、FN、MMP-3、TIMP-1mRNA表达水平明显增加(蛋白: α-SMA:0.75±0.03,0.94±0.01,1.04±0.04vs0.48±0.02; Col1α2:0.43±0.01,0.54±0.02,0.57±0.03vs0.19±0.05; Col3α1:0.45±0.02,0.41±0.02,0.59±0.03vs0.26±0.04; MMP-3:0.28±0.10,0.35±0.02,0.39±0.02vs0.19±0.03; TIMP-1:0.60±0.01,0.61±0.02,0.83±0.01vs0.31±0.01, P<0.05; mRNA: Col1α2:2.63±0.33,2.80±0.27,2.52±0.24vs1.00±0.39; Col3α1:1.31±0.24,1.23±0.15,2.60±0.29vs1.00±0.24; FN：2.36±0.38,1.56±0.46,5.01±0.38vs1.00±0.38; MMP-3:1.38±0.28,1.12±0.28,4.44±0.23vs1.00±0.23; TIMP-1:1.56±0.48,1.55±0.45,5.29±0.03vs1.00±0.56, P<0.05)。⑧Western blot和real-time Q-PCR检测结果显示：与Control组相比，TL1A组、TGF-β1组、TL1A+TGF-β1组CCD-18Co中TGF-β1、p-Smad3蛋白以及TGF-β1、Smad3mRNA表达水平明显增加(蛋白: TGF-β1:0.48±0.02,0.80±0.04,0.89±0.03vs0.24±0.01; p-Smad3:0.92±0.02,0.89±0.05,1.33±0.03vs0.59±0.03, P<0.05; mRNA: TGF-β1:1.26±0.10,1.57±0.10,1.94±0.10vs1.00±0.10; Smad3:1.29±0.27,1.54±0.27,2.99±0.27vs1.00±0.25, P<0.05)。结论：TL1A对TGF-β1介导的肠成纤维细胞活化增殖及胶原沉积有协同作用；其机制可能与TGF-β1/Smad3信号通路增加有关。