论文部分内容阅读
我国是传统的养猪业大国,每年的生猪出栏量和存栏量均稳居世界第一位。然而,困扰养猪业的一大问题是如何防治层出不穷的传染性疾病,因为这些传染疾病每年都会给养猪业带来巨大的经济利益损失。这些具有传染性的病毒特别是一些RNA病毒在猪只传播过程中容易发生重组和突变,因此传统的疫苗和兽药并不能完全解决这些问题。近年来利用分子生物学技术,在猪基因组水平鉴定抗病毒关键因子,进而对发现的抗病基因进行修饰,使猪只获得抗病能力的研究越来越受到科研人员的重视。然而,如何有效快速准确地鉴定出抗病候选基因,是目前该研究领域的一个难点。作为第三代基因编辑技术,CRISPR/Cas9系统自从诞生以来迅速应用到生命科学的各个领域,尤其是该技术获得了2020年度诺贝尔化学奖,就愈发使得该技术变得炙手可热,在农业动物遗传育种领域也大显身手。其次,三维基因组技术的快速发展使得在细胞水平对基因组的三维结构变化进行研究并鉴定调控元件成为可能。本研究首先利用CRISPR/Cas9系统制备了猪繁殖与呼吸综合征病毒受体CD163基因SRCR5序列缺失的克隆猪;其次在猪基因组中鉴定了新型友好位点,并构建了对猪繁殖与呼吸综合征病毒易感的细胞系,并利用CUT&Tag技术对PRRSV敏感度不同细胞的调控元件进行了鉴定,并分析了影响3D4/21-CD163细胞对PRRSV易感的潜在原因,具体结果如下:（1）采用不同分离方法对猪胎儿成纤维细胞系的分离和培养方法进行了比较和摸索,确定了最佳方法;针对猪CD163基因SRCR5结构域,设计并构建了配对的sgRNA进行敲除,并结合胚胎移植和体细胞核移植技术获得了一头CD163基因SRCR5序列缺失的克隆猪。（2）通过CRISPR/Cas9系统介导的同源重组技术,将GFP基因定点整合至猪基因组内源GAPDH基因的下游,成功使GFP蛋白在内源GAPDH基因启动子的驱动下表达。进一步分析发现,定点敲入GFP基因后,不会影响GAPDH基因及相邻基因的表达。因此,GAPDH基因可以视为一种新型的友好基因座。（3）通过CRISPR/Cas9系统介导的同源重组技术,将猪CD163基因编码区序列定点整合至猪3D4/21细胞基因组Rosa26位点;后续实验证明,CD163蛋白在3D4/21细胞系中成功表达;攻毒实验证明,3D4/21-CD163细胞系对猪繁殖与呼吸综合征病毒敏感。（4）在全基因组范围内,对3D4/21细胞和3D4/21-CD163细胞的启动子和增强子信号进行鉴定,进行了H3K4me3、H3K27ac和CTCF的CUT&Tag实验,并分析了这些组蛋白因子的信号富集情况。在3D4/21细胞和3D4/21-CD163细胞中分别鉴定了32786、35790个启动子和22520、29248个增强子,其中活跃启动子数目为12372、15751个。（5）通过联合分析RNA-seq和CUT&Tag数据,发现3D4/21-CD163细胞与3D4/21细胞差异表达基因中,组蛋白H3K4me3和H3K27ac信号显著富集于上调表达基因中。这些说明,3D4/21细胞在超表达CD163基因后,激活了部分调控元件,使细胞趋于活跃状态。（6）发现在3D4/21细胞和3D4/21-CD163细胞中CTCF信号的变化对基因表达有影响,即CTCF信号减少会导致基因表达量下降;进一步分析发现,与3D4/21细胞相比,CTCF信号在3D4/21-CD163细胞免疫基因启动子区域下降可能导致了免疫基因表达量下降,进而增加对PRRSV敏感性。（7）在3D4/21细胞和3D4/21-CD163细胞中,分别鉴定到了总loop数是6292个和10981个,其中启动子和启动子之间互作的loop数目分别为362个和1662个,启动子和增强子之间的互作数为434和1283个;进一步分析发现,3D4/21细胞中loop主要发生地是短距离互作,3D4/21-CD163细胞则主要发生长距离互作;说明在整合CD163基因后,3D4/21-CD163细胞结构更为松散。