假单胞菌M18(Pseudomonas sp. M18)分离自上海郊区甜瓜根际,能够分泌具有广谱抑菌活性的次生代谢物吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid,PCA),是一株具有生物防治功能的新型菌株。现已证实PCA合成受到全局性双元调控系统GacA/GacS、群体感应(Quorum sensing,QS)系统及环境条件等多种因素的影响。本研究从分子水平上分析了M18菌株中phz合成基因簇的特点,阐明了GacA/GacS和QS系统对M18菌株中吩嗪合成基因簇(phz)的调控作用;并进一步从细胞水平上研究环境条件对PCA合成的影响,进而通过发酵培养基营养组分的优化,分批发酵及流加发酵优化控制等策略逐步提高PCA产量,旨在为实现PCA商业化应用提供理论依据和技术支持。主要包含三部分:第一、确定菌株M18中含有两个吩嗪合成基因簇假单胞菌株M18兼有荧光假单胞菌和铜绿假单胞菌的遗传学背景,而且假单胞菌株M18与铜绿假单胞菌均可以产生PCA,推测M18菌株与铜绿假单胞菌具有类似的phz合成基因簇。据此,设计保守引物并扩增得到M18的phz合成基因簇及两侧序列,序列分析显示:假单胞菌株M18与铜绿假单胞菌株PAO1(Pseudomonas aeruginosa PAO1)中的两个phz合成基因簇高度相似,结构基因及两侧修饰基因的同源性均在99%以上;不同的是,M18菌株phz2基因簇的下游多出三段144bp的重复序列。根据两个phz基因簇phz1和phz2上游调控区序列的差异设计引物,以M18菌株为出发菌株分别构建phz1和phz2基因簇失活突变株,研究菌株M18的两个phz基因簇的表达特点及对产物PCA合成的影响,结果表明:phz2基因簇对PCA合成起主要贡献,且受环境条件影响。这意味着假单胞菌M18虽与铜绿假单胞菌PAO1有较为相似的遗传学背景,但在调控PCA的合成表达方面仍存在一定的差别。第二、菌株M18吩嗪合成的分子调控机制(1)基于全局调控系统GacA/GacS中的gacA突变株M18G,分别构建了基因簇phz1和phz2失活的双突变株M18GP1和M18GP2,研究了全局性调控元件GacA在PCA合成中的调控作用。运用荧光定量PCR (qRT-PCR)和转录融合(phz-lacZ)活性测定表明,在野生菌株M18中,GacA在转录水平促进phz1基因簇表达,但抑制phz2基因簇表达,从而有选择性地调控两个phz基因簇的表达;菌株M18的gacA基因抑制PCA合成,这与所报道的PAO1菌株中GacA促进phz基因簇表达的调控方式相反。(2)研究了两个phz基因簇调控区域及GacA/GacS如何调控两个基因簇的表达。首先运用5’-RACE方法确定了基因簇phz1和phz2的转录起始位点;其次对两个phz基因簇调控区进行系统性缺失并与lacZ构建融合。通过β-半乳糖苷酶活性测定表明,基因簇phz1启动子下游1～90bp调控区域使其基因表达活性下降10倍, phz2启动子下游1~131bp调控区均存在抑制子使表达活性降低2~3倍,各融合片段转化到gacA突变的菌株M18G中,结果表明: GacA负调控phz2的表达,对phz1表达活性基本没有影响。因此,菌株M18中GacA在转录和转录后水平促进phz2表达,从而促进PCA合成。(3)进一步研究群体感应LasR和RhlR系统对两个phz基因簇的调控作用表明,RhlR蛋白正调控phz1和phz2表达,而LasR有区别性调控两个基因簇的表达,即正调控phz1表达,但负调控phz2表达。相应地,在M18菌株中,RhlR促进PCA合成,LasR则抑制PCA合成,这一结果和菌株PAO1中LasR促进吩嗪PYO的合成相反。菌株M18和菌株PAO1中,GacA/GacS和群体感应系统不同的调控方式及引起的吩嗪类产物合成的差异性可能归结于它们在不同生境的选择压力下长期进化的结果。(4) GacA/GacS负调控M18中PCA合成,gacA基因突变株M18G中PCA合成提高了30倍。以此为基础,研究不同环境条件对GacA/GacS介导的PCA合成的调控表明,野生型菌株M18中的PCA双元调控系统GacA/GacS对高温、高浓度氧、偏酸或偏碱性环境敏感;而缺失全局调节子GacA的突变株M18G能显著提高对敏感环境的耐受性。模拟根际环境中的不同营养因子对PCA合成的影响表明,GacA突变株M18G和菌株M18对营养物质的吸收利用存在着差异。碳源和有机氮源有利于促进菌株M18G的PCA合成。显然,突变株M18G具有高产PCA的潜力和对环境的耐受性。因此,在初步研究菌株M18代谢合成PCA的遗传机制基础上,本文对突变株M18G的发酵条件进行了优化,旨在提高其代谢合成PCA的产量。第三、菌株M18G吩嗪合成的发酵规律研究(1)通过Plackett-Burman实验设计初步筛选了12种影响PCA合成的营养因子;进一步采用响应面方法确定了突变株M18G发酵生产PCA的关键营养要素,优化了发酵培养基中各营养因子的浓度,即黄豆粉33.4 g/L,葡萄糖12.7 g/L,大豆蛋白胨10.9 g/L,乙醇13.8 g/L,证实黄豆粉和乙醇是促进PCA合成的最关键因素,这一结果在10 L发酵罐发酵实验中得到了进一步验证。利用优化培养基可以使PCA产量达到1.8 g/L,比优化前提高了6倍。(2)建立起突变株M18G的分批发酵动力学模型,探索了分阶段发酵过程中转速和pH值优化控制策略对PCA合成的影响。结果表明,在转速250 rpm条件下,菌株M18G发酵48 h后,PCA最大产量1873 mg/L。根据分批发酵的菌体生物量、底物消耗量及产物合成量三个参数建立了菌株M18G发酵生产PCA的动力学模型,构建模型的计算值与实际值的拟和性良好。利用分阶段控制转速的策略可以使PCA产量最高达2190 mg/L;发酵后期pH控制在7.0可以防止PCA降解或转化为其他物质。通过分段控制转速以及维持发酵后期培养介质的pH在7.0将有利于PCA合成。(3)培养介质中的初始糖浓度及溶氧浓度对突变株M18G合成PCA有一定的影响,初始葡萄糖浓度宜控制在12～14 g/L,提高葡萄糖的初始浓度会产生底物抑制作用,抑制PCA的生成。发酵后期溶氧浓度(DO)控制在20%以下有利于PCA合成。采用以DO为反馈指标,两阶段间歇式流加葡萄糖(总量控制在6.6 g/L)方式发酵PCA,可以使PCA合成产量及速率最高分别达到2597 mg/L和36.1 mg/L·h,和分批发酵相比分别提高了31.7%和9.39%。综上,本文研究以假单胞菌M18作为研究菌株,证实其两个phz合成基因簇受双组分转导系统GacA/GacS和群体感应QS系统差异性调控的分子机制,并且构建的GacA的突变株(或工程菌)M18G,显著提高PCA产量和对敏感环境的耐受性,对其PCA合成进行从培养基到发酵罐逐步优化策略,大大提高了PCA的产量,为实现PCA商业化发展奠夯实基础。