黑色素是动物组织中的一种重要物质,分布较为广泛。动物体表之所以颜色各异、色素图案丰富,与黑色素及其细胞的分布和发育差异有着密不可分的关系。不同的色素图案具有生物伪装、求偶和示威等重要作用,这在鱼类中表现尤为明显。作为我国比目鱼类中一种主要的养殖品种,半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)经常发生无眼侧黑化(melanism)、有眼侧白化(albinism)这两种体色异常现象,对养殖业造成了巨大的经济损失。本文以半滑舌鳎为对象,克隆了两个体色相关基因酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)基因、多巴色素异构酶(Dopachrome tautomerase,DCT)基因的c DNA序列,并分析了相关序列,探讨了两个基因在不同组织的表达情况,同时对黑色素形成进行了研究,并探讨了其生长发育的特征,从而为寻找半滑舌鳎体色调控机制提供了依据。主要研究成果如下:1.半滑舌鳎TYR基因的克隆与组织表达特性利用RT-PCR技术获得了半滑舌鳎的TYR基因的编码区序列,再通过定量分析的方式确定基因的组织表达特征。TYR的编码蛋白共有539个氨基酸构成,预测分子量为61.008k D。氨基酸同源性分析显示,半滑舌鳎TYR与其他鱼类的相似度高达80%-85%,与爬行动物、鸟类和哺乳动物存在50%以上的相似度,由此可见其具有进化保守性。实时荧光定量结果显示,在半滑舌鳎成鱼眼睛组织中该基因呈现高度表达状态,黑色皮肤(包括有眼侧正常皮肤、无眼侧黑化皮肤)和肝脏呈现较高表达状态,且显著高于白色皮肤(包括有眼侧白化皮肤、无眼侧正常皮肤)、脾脏和肌肉组织。由此推测,TYR基因在黑色皮肤中的特异表达与其调控黑色素的合成有关。2.半滑舌鳎DCT基因的克隆与组织表达特性DCT基因是一种酪氨酸酶基因,在黑色素合成过程中具有重要的作用,该基因的表达能够影响酪氨酸酶的活性以及黑色素合成的效率。本部分通过基因克隆技术获得了半滑舌鳎DCT基因的编码区序列,该基因编码的DCT蛋白由516个氨基酸组成,预测分子量为57.948k D。氨基酸同源分析显示,半滑舌鳎DCT与其他鱼类相似度达71.52%-88.05%,与爬行类、鸟类以及哺乳类存在50%以上的相似度,由此可见其具有进化保守性。实时荧光定量结果显示,在半滑舌鳎成鱼眼睛组织中该基因呈现高度表达状态,在肝脏与黑色皮肤中也有较高表达,其它各组织几乎不表达。结果表明,DCT与TYR表达模式类似,推测DCT在半滑舌鳎黑色素合成过程中与TYR起着重要的协同作用。3.TYR、DCT基因在半滑舌鳎不同发育时期的表达特征本部分主要通过实时荧光定量技术,显示了半滑舌鳎仔鱼以及幼鱼、成鱼各组织的时空表达差异。TYR和DCT在20日龄前鱼苗体内表达量较高,尤其是在变态关键时期(15-20日龄)表达量最高,30日龄时表达量锐减到很低水平。由此可见,上述两个基因与半滑舌鳎的变态发育有一定的关联。自出膜3个月的幼鱼期到12个月的成鱼期过程中,半滑舌鳎黑色皮肤中TYR和DCT的表达均显著高于白色皮肤。结果表明,TYR在半滑舌鳎有眼侧正常皮肤(黑色)的表达具有显著递增的趋势(p<0.05),在无眼侧正常皮肤、无眼侧黑化和有眼侧白化皮肤上无明显变化趋势。DCT在有眼侧正常皮肤(黑色)、无眼侧黑化皮肤、无眼侧正常皮肤(白色)的表达均具有显著递增的趋势(p<0.05)。综上所述,TYR基因和DCT基因与半滑舌鳎皮肤中黑色素合成密切相关,并发挥着一定的调控作用。通过调控这两个基因来解决半滑舌鳎的体色异常问题,还有待后续实验进行验证。